Biochimica applicata medica

SPETTROFOTOMETRIA

Valuta la frazione di intensità di radiazione visibile che una sostanza riflette per diffusione quando è colpita

da luce di diverse lunghezze d’onda. La misura è data dalla curva dell’andamento del coefficiente di

riflettanza in funzione della lunghezza d’onda della radiazione incidente.

Lo spettrofotometro è uno strumento che

determina il valore dell’assorbanza di una

sostanza inserita in una cuvetta ad una

determinata lunghezza d’onda.

È costituito da: sorgente luminosa,

monocromatore per selezionare la lunghezza

d’onda, una piccola fessura per selezionare il raggio, l’alloggio per la cuvetta, un fotometro, un

amplificatore del segnale e infine un display che mostra il risultato.

Nell’analisi di una sostanza con normali spettrofotometri che vanno dal campo dell’UV al visibile lo spettro

(assorbanza) è dato dallo spettro incidente meno lo spettro di assorbimento.

L’analisi si basa sulla misura dell’assorbanza di una determinata soluzione, che è il risultato di una

reazione colorimetrica biochimica effettuata a una specifica lunghezza d’onda.

Per eseguire analisi quantitative si usano radiazioni monocromatiche→ occorre fare una curva standard di

calibrazione usando soluzioni standard per poter poi risalire alle concentrazioni incognite dei campioni.

Per eseguire analisi qualitative si usano raggi policromatici a spettro continuo.

TURBIDIMETRIA

Viene utilizzata una radiazione monocromatica che attraversa un sistema disperso (es. sospensioni molto

misurando l’estinzione

diluite). Sono usati spettrofotometri normali che sfruttano la legge di Lambert-Beer

d’onda che non viene assorbita.

molare ad una lunghezza

La diffusione varia al variare della lunghezza d’onda in misura molto minore dell’assorbimento.

L’intensità della luce trasmessa è inversamente proporzionale alla quantità di particelle sospese e ha la

stessa direzione della luce incidente.

È una misura rapida, ma non molto accurata. Permette di rilevare albumine, plasmaproteine, proteine delle

urine, beta-lipoproteine e Ag che hanno reagito con Ac.

NEFELOMETRIA

Si basa sulla determinazione della quantità di sostanza in sospensione. Vengono usati speciali fotometri

misurazione dell’intensità della radiazione che viene diffusa.

detti nefelometri→ Il percorso va dalla

sorgente luminosa al fotorilevatore, ma non in linea retta.

Prevale l’effetto diffusivo, effetto Tyndal (diffusione della luce rendendo visibile un raggio, la soluzione non

disperde la luce→ soluzioni colloidali).

L’intensità della luce trasmessa è inversamente proporzionale alla quantità di particelle sospese e ha

direzione perpendicolare rispetto alla luce incidente.

È una misura più sensibile e più precisa. Permette di rilevare lipoproteine, amilasi, lipasi e proteine urinarie.

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RIA

Combina una reazione immunologica altamente specifica con un metodo radiochimico estremamente

sensibile. L’Ag marcato è aggiunto alla reazione in quantità note e la rilevazione e quantificazione

dell’analita nel campione biologico (Ag freddo o non marcato) sono possibili grazie alla misura della

radioattività emessa durante la formazione dell’immunocomlesso. L’Ac non discrimina tra Ag marcato e Ag

freddo e si crea una competizione tra i due. Il conteggio della radioattività è inversamente proporzionale

all’Ag presente.

Si usano: 125

- Iodio 125 ( I)→ emivita di 60 giorni, radiazioni gamma

60

- Cobalto 60 ( Co)→ emivita di 267giorni, radiazioni gamma, per il dosaggio della vitamina B 12

3

- Trizio 3 ( H)→ emivita di 12.26 anni, radiazioni beta, per il dosaggio di steroidi e farmaci

Si usa per ormoni, ferritina, Ag virali e antigene carcinoembrionario (CEA).

IRMA -15

Utilizza Ac legati a traccianti radioattivi, ha una sensibilità fino a 10 g. Gli Ac marcati reagiscono con il

campione fino a marcare tutto l’Ag. Si dosano direttamente gli Ac marcati e il conteggio della radioattività è

direttamente proporzionale all’Ag presente.

FIA

Si basa sull’uso di Ac marcati con composti fluorescenti detti fluorocromi

(→ sostanze colorate che se illuminate con UV emettono luce nel

visibile). Ha una sensibilità nell’ordine del 10 -8

g. La fluorescenza degli Ac

marcati è quantificabile con un fluorimetro.

Tra i più diffusi composti fluorescenti, con spettri di eccitazioni e di emissione ci sono:

- Fluoresceina o isotiociato di fluoresceina→ vediamo la molecola, lo spettro di assorbimento e quello

di emissione

- Tetrametilrodammina→ vediamola la molecola e gli spettri

- Umbelliferone

EIA

È l’evoluzione del RIA→ la marcatura è resa più stabile, il legame specifico Ac-Ag è individuato da

L’attività enzimatica

marcatori enzimatici come perossidasi di rafano, fosfatasi alcalina e beta-galattosidasi.

Tecnica meno pericolosa per l’operatore→

-12

amplifica la reazione e si ha una sensibilità fino a 10 g. non si

usano traccianti radioattivi

Il cambiamento di colore, o segnale luminoso, è rilevato da un fotometro.

Può essere di due tipi:

l’enzima legato all’Ac è da dosare, rimane attivo se non lega l’Ag mentre viene

- Omogeneo→ L’attività dell’enzima si può misurare direttamente nella

inattivato se si verifica la reazione Ag-Ac.

miscela (→ è definito anche EMIT (enzyme multiplied immunoassay technique))

l’enzima è attivo sia con il composto marcato libero che legato all’Ag, per la misura è

- Eterogeneo→

necessario separare le due frazioni 44

ELISA intrappola l’Ag tra due Ac

È una metodica estremamente versatile. ELISA diretto è la più utilizzata→

(primario e secondario). Può essere di 3 tipi:

- Diretto

- Dosaggio non competitivo→ metodo a due siti o a sandwich

- Dosaggio competitivo

In tutti i casi si sfrutta la reazione specifica Ag-Ac e la presenza di un enzima coniugato con una sostanza

capace di emettere fluorescenza/luminescenza per poter essere rilevata.

TECNICHE IMMUNOCHIMICHE

Anticorpi monoclonali

Traccianti utilizzabili nelle tecniche immunochimiche e la loro tipologia di emissione

Caratteristiche dei metodi immunochimici omogenei ed eterogenei

Classificazione dei metodi immunochimici che non impiegano un tracciante

Classificazione dei metodi per l’elaborazione della relazione tra concentrazione e segnale analitico 45

ELETTROFORESI CAPILLARE

Permette di rilevare e quantificare le proteine, di riconoscerne le alterazioni nel loro contenuto nel siero e

nelle urine (→ disprotidemie, infezioni, stati infiammatori generali, carenza di immunoblobuline,

gammopatie monoclonali, funzionalità epatica).

Le proteine vengono separate per la loro diversa mobilità in un campo elettrico in un tampone alcalino

all’interno di un capillare (50 μm). Le differenze di velocità dipendono dal pH dell’elettrolita e dal flusso che

si crea nel capillare (flusos elettroendosmotico). Le proteine sono rilevate e quantificate per misura diretta

dell’assorbanza alla lunghezza d’onda di 214nm (evitando colorazione e decolorazione).

Vantaggi:

- Possibilità di usare quantità molto piccole di campione

- Applicabilità a molti tipi di molecole, non solo proteine

- Si svolge in pochi minuti

Ha un’elevata sensibilità

-

Limiti:

- Elevate differenze di potenziale durante la corsa e conseguente sviluppo di calore

Capillari con lunghezza tra 50 e 100 μm per dissipare il calore

-

CITOMETRIA A FLUSSO

Permette di contare, selezionare e isolare elementi corpuscolati e cellule opportunamente marcate con un

fluoroforo e fatte passare singolarmente attraverso un sistema ottico di rilevazione a flusso laminare.

Gli elementi non corpuscolati (allergeni) sono fatti adsorbire su strutture inerti cromaticamente (microsfere

in lattice) di dimensioni assimilabili a quelle di una cellula.

Ciascuna cellula è attraversata da un fascio di luce che eccita i fluorocromi e causa l’emissione di un

segnale fluorescente. I dati vengono visualizzati come grafici

È una tecnica multiparametrica→ permette di valutare in una popolazione cellulare mista diversi parametri

per ogni cellula in sospensione (da fluidi biologici o tessuti solidi disgregati). Vengono valutate la vitalità, la

dimensione, la complessità e il fenotipo.

Si utilizza per:

- Studio della proliferazione cellulare

- Analisi del ciclo cellulare

- Analisi immunofenotipica

Studio dell’apoptosi

-

Vantaggi:

- Possibilità di esaminare un elevato numero di cellule

- Rapidità dei tempi di analisi

- Obiettività

- Riproducibilità delle letture

HPLC

È un’analisi quali-quantitativa. La separazione tra le diverse molecole presenti in un solvente si ha grazie al

differente tempo di ritenzione. 46

UFLC MS/MS

È un metodo quali-quantitativo. Combina la separazione delle molecole mediante cromatografia liquida con

la caratterizzazione eseguita in MS/MS (spettrofotometria di massa in tandem). Ha elevata sensibilità e

selettività.

Consente di determinare la massa molecolare e identifica un composto in una miscela di composti→

fornisce profili di frammentazione. La quantità di campione necessaria per avere uno spettro è μg/ng,

inserito in una camera di ionizzazione allo stato liquido, solido o gassoso.

Si usa per:

- Processi di glicosilazione non enzimatica di gruppi prostetici

- Diagnosi neonatale di malattie metaboliche lisosomiali

DETERMINAZIONI ENZIMATICHE

Gli enzimi regolano, mantenendo l’omeostasi cellulare, tutte le reazioni delle vie metaboliche cellulari.

Dipendono, nella loro attività, oltre che dalla concentrazione di substrato anche da quella di altri metaboliti

(precursori o prodotti) più o meno lontani dalla via metabolica stessa.

L’obiettivo è conoscere:

- Enzimi e isoenzimi (stessa attività catalitica, ma diversa struttura e provenienza) più importanti da

un punto di vista clinico-diagnostico

- La distribuzione nelle cellule e nei tessuti

- Le modificazioni indotte dalle patologie

Si usano come:

- Indicatori di funzionalità o di lesione di cellule e tessuti

- Marcatori di specifici deficit enzimatici nelle malattie genetico-metaboliche

Le variazioni dell’attività enzimatica nel siero di enzimi di origine cellulare sono il fondamento della

diagnostica enzimatica. I dosaggi usati a scopo diagnostico sono numericamente limitati (solo una decina

son