Batteriologia per l'esame di Microbiologia

ANTIBIOTICO-RESISTENZA

I batteri, nel tempo, in base anche a determinate pressioni, hanno sviluppato sempre più resistenze. La resistenza può essere: - Naturale o intrinseca: microorganismi naturalmente resistenti per determinate caratteristiche. Il biofilm è una forma di resistenza. - Genica: dovuta a mutazioni a livello dei geni del batterio, si può dividere in due categorie: 1. Cromosomico: mutazioni spontanee in alcuni punti del cromosoma portano allo sviluppo di un gene diverso e quindi a resistenza. Frequenza abbastanza bassa, più gestibile; può essere trasmessa alla cellula figlia. 2. Extra cromosomico: più frequente, dovuta a trasferimento genico orizzontale. I batteri che trasportano queste resistenze, in genere, ce l'hanno verso più antibiotici, resistenza multipla. Meccanismi di resistenza: 1. Modificazione della permeabilità della parete del batterio: l'antimicrobico non riesce a penetrare. 2. ...Inattivazione extracellulare dell'antibiotico beta-lattamasi o penicillasi agiscono sull'antibiotico e lo distruggono →3. Inattivazione intracellulare dell'antibiotico endo-beta-lattamasi tipiche dei batteri →Gram negativi, sono numerose nello spazio periplasmatico le endo-beta-lattamasi agiscono anche sulle cefalosporine →4. Modifica delle strutture bersaglio se il batterio ha modificato il bersaglio, non viene più attaccato dall'antimicrobico esempio: la resistenza alla meticillina è data da una modifica della PBP →5. Pompe di efflusso attivo strutture che fanno da pompa in cui il farmaco entra e viene spedito fuori dalla cellula spesso hanno capacità di espellere più tipi di farmaci diversi →6. Sovraproduzione del target →7. Iperproduzione di enzimi inattivanti che legano l'antibiotico effetto spugna o trapping le beta-lattamasi vengono iperprodotte e precipitano nello spazio periplasmico causando intasamento e

impedendo al beta-lattamico di raggiungere il bersaglio

Acquisizione della resistenza → Ha giocato un ruolo importante l'uso improprio e massivo degli antimicrobici in zootecnia e agricoltura. Ha influito anche l'uso improprio per curare malattie non di origine batterica o l'utilizzo estensivo per tempi prolungati. → Uno dei problemi del futuro è cercare di contrastare l'antibiotico-resistenza scoprire antibiotici che possano agire per un ampio spazio temporale. È importante sempre effettuare un test per conoscere il farmaco più adatto alla condizione del paziente in carico. → Esistono microorganismi multiresistenti importanti dal punto di vista clinico, organismi alert. Tra questi:

• MRSA (stafilococchi resistenti alla meticillina)
• Enterococchi soprattutto a livello ospedaliero
• Enterobacteriaceae
• Micobatteri

Il paziente deve essere più possibile isolato evitare la trasmissione del microorganismo resistente.

Determinazione in vitro

della sensibilità batterica ai chemioantibiotici. Per sapere se un microorganismo è sensibile o resistente a un farmaco si effettua l’antibiogramma, che serve anche per decidere come trattare il paziente. Le tecniche che si possono utilizzare sono di diverso tipo: - Microdiluizione in brodo: permette di determinare la MIC (concentrazione minima inibitoria). Viene inoculata una concentrazione fissa di microorganismo in presenza di concentrazioni scalari del farmaco da testare. Il punto in cui non c’è crescita batterica è la MIC. Dalla MIC è possibile calcolare la MBC (concentrazione battericida minima). Si preleva dal primo punto in cui non c’è stata crescita, si mette in piastra e si valuta la crescita dopo 24 ore. La MIC non implica che il batterio sia morto, non sempre la MIC e la MBC coincidono. - Agar diffusione secondo Kirby-Bauer: si utilizzano dischetti imbevuti con una concentrazione fissa di farmaco. Si pongono sulle piastre su cui sono state fatte crescere le colonie di microorganismi. La dimensione dell’inibizione attorno al dischetto permette di valutare la sensibilità del batterio al farmaco.microorganismo e si vede se intorno ai dischetti si sviluppa crescita batterica. La misura dell'alone di inibizione determina se il batterio è resistente o sensibile (in base al diametro dell'alone). Il test Epsilon-test utilizza l'agar diffusione contro gradiente. Si utilizzano strisce di carta che presentano una concentrazione scalare del farmaco. La striscia viene posizionata dopo l'inoculo del batterio sulla piastra e si formerà un alone di inibizione a forma di goccia. Il punto in cui si ha la punta della goccia rappresenta la minima concentrazione inibente. L'antibiogramma segue dei parametri delle linee guida definiti per valori soglia dei parametri farmacologici che permettono di definire se la resistenza è completa o intermedia. Tuttavia, questi test in vitro non sempre hanno un'efficacia reale e dipendono anche dalla sede di infezione e da altri parametri. Regola base: se si trova un microorganismo in concentrazione superiore alla MIC, si ha quasi certezza della resistenza.

funzionalità; se la concentrazione è inferiore a quella della MIC, il farmaco non funzionerà. Tutti questi test si basano su linee guida dei valori soglia dei parametri continuamente aggiornati in Europa dall'EUCAST. Non sempre il farmaco con la MIC più bassa è quello che funziona meglio, dipende anche dai valori soglia definiti.

BATTERIOLOGIA SPECIALE

GLI STAFILOCOCCHI

Cocchi = forma rotondeggiante

Stafilo = raggruppati a grappoli

Famiglia: Micrococcaceae

Identificate più di 50 specie, ma solo alcune sono responsabili di infezione. Tra gli stafilococchi più importanti ci sono:

• S. aureus
• S. epidermidis
• S. saprophyticus
• S. hominis
• S. haemolyticus

Sono perlopiù normali commensali presenti sulla cute e sulle mucose, tipicamente non causano patologia. Solo lo S. aureus è considerato un vero e proprio patogeno.

Batteri Gram positivi, immobili, asporigeni. Sono molto resistenti, resistono bene a condizioni di stress ambientale.

Sono agenti patogeni piogeni sono in grado di causare infezioni caratterizzate dalla formazione di essudato purulento: ascesso se è una neoformazione, empiema se si forma in una cavità preformata. Normalmente hanno diametro di un micrometro al massimo. Sono aerobi-anaerobi facoltativi, non particolarmente esigenti possono usare sia metabolismo ossidativo che fermentazione. Vengono visualizzati bene su terreni base, ma su terreni specifici si può aumentare la concentrazione di sale, in quanto microorganismi alofili. Identificazione degli stafilococchi: - Test della catalasi: lo stafilococco produce l'enzima catalasi (converte il perossido di idrogeno in acqua e ossigeno). Gli stafilococchi sono catalasi positivi. - La catalasi è in grado di inibire la mieloperossidasi. Questi batteri sono in grado di sopravvivere e riprodursi all'interno dei fagociti. - Test della coagulasi: serve per identificare le diverse specie di Stafilococchi. Solo lo S.

aureus è in grado di rilasciare l'enzima coagulasi. La coagulasi viene prodotta come proenzima, ma una volta attivata converte il fibrinogeno in fibrina. La fibrina riveste i batteri formando un coagulo inattaccabile dal sistema immunitario e dai fagociti. Esistono diversi test per identificare gli Stafilococchi coagulasi positivi o negativi.

Habitat e diffusione: Batteri normalmente presenti nella microflora di diversi mammiferi e si trovano anche nell'ambiente. Sono particolarmente resistenti. Sono patogeni importanti in ambiente ospedaliero (in particolare l'aureus) hanno sviluppato molto velocemente resistenza a farmaci batterio multiresistente. L'aureus è diventato resistente molto velocemente a una penicillina semisintetica detta meticillina, ceppi meticillino-resistenti, MRSA. L'aureus è importante per i suoi meccanismi di patogenicità e per la resistenza agli antibiotici. È normalmente presente a livello della

microflora cutanea portatori asintomatici diffusione alivello ambientale. Fattori di virulenza Lo S. aureus ha diverse componenti strutturali e molecole rilasciate che gli conferiscono virulenza: 1. PROTEINA A: sporge dalla superficie del batterio, è in grado di legare il frammento Fc delle IgG bloccandole blocca l'attivazione della fagocitosi e del complementoinibitore con attività antifagocitaria e anti-attivazione del complemento. 2. COAGULASI: può essere rilasciata in forma libera o in forma legata (clumping factor) interagisce col fibrinogeno e fa sì che si formi il coagulo di fibrina attorno al clump di batteri protegge il batterio dal sistema immunitario. 3. ACIDI TEICOICI: costituenti della parete dei batteri funzione immunogena e di adesione alle mucose S. aureus ha i poliribitol fosfati, gli altri Stafilococchi hanno igliceroli fosfati. 4. GLICOCALICE: capsula non ben strutturata e formata, di natura

polisaccaridica–funzione antifagocitaria e favorisce l'adesione si può avere formazione di biofilm.

Esoenzimi:

• Coagulasi–blocca la fagocitosi e protegge il batterio
• Stafilochinasi–converte il plasminogeno in plasmina inducendo la lisi della fibrina–rompe il coagulo che si era formato intorno al clump spreading factor
• Ialuronidasi–scinde l'acido ialuronico che compone la matrice del connettivo–favorisce la diffusione
• Lipasi–agisce sui lipidi a livello cutaneo favorisce la colonizzazione
• Catalasi
• Esterasi, proteasi, DNAsi–favoriscono la diffusione del batterio
• Penicillasi (β-lattamasi)–tagliano l'anello β-lattamico di cui sono costituite penicilline e derivati–inibisce l'attivazione dell'antibiotico

Tossine:

Gli Stafilococchi producono una serie di esotossine, alcune specie-specifiche, altre presenti in tutti i batteri della famiglia:

• Emolisine α, β, γ, δ–citotossine che

agiscono sulla cellula portando alla formazione di pori, squilibrio osmotico e lisi della cellula -> attaccano prevalentemente gli eritrociti

Un tipo particolare di emolisina è la leucocidina di Panton-Valentine, tossica per i leucociti.

Enterotossine agiscono a livello intestinale, ne esistono 7 tipi diversi responsabili dell'intossicazione alimentare.

Tossina dello shock tossico (TSST 1) funziona da superantigene: induce un'attivazione spropositata di linfociti T e porta al rilascio abnorme di citochine pro-infiammatorie - cytokine storm shock.