Batteri, membrana batterica gram+ e gram-, sepsi, terapia antiendotossinica con cartuccia assorbente

Con l infezione che sfocia in SIRS si ha l attivazione del sist del

complemento (risp infiamm) e della coagulazione, i monociti si

trasformano in macrofagi, producono segnali biochimici es citochine che

stimolano il sist del complemento e hanno ruolo proinfiamm, e mandano

un segnale anche alla coagulazione a cascata che produce altre molecole

pro-infiammatorie. Quindi non abbiamo un bilancio tra fattori pro e anti

infiamm, le risposte hanno un feedback loop positivo con

oscillazioni che si amplificano nel tempo. Quindi dobbiamo fermare

questo circolo dall esterno: terapie con la proteina C, che è molto

prodotta durante le infezioni per spegnere le infiammaz;

corticosteroidi, che stabilizzano i lisosomi che distruggono i

batteri. Ci sono anche terapie + tradizionali, come il supporto

extracorporeo non renale, quindi

viene filtrato il sangue, oppure con filtrazione del plasma per filtrare le

citochine pro-infiamm.

Nella sepsi grave, posso agire con supporto d organo al sist

cardiovascolare con pompa, al sistema respiratorio con ventilatore, al sist

renale con emodialisi.

Ruolo endotossine. L infezione dei gram- è dovuto ai lipopolisaccaridi. I

LPS sono formati da un lipide A + catena polisaccaridica. Il lipide A è la

parte tossica, anche da sola fa male. L infezione che progredisce nel

tempo determina uno stato patologico cronico. Sono definite esotossine

per i gram+, perché viene prodotta e secreta, e endotossine per i

gram-, perché è inclusa nell outer membrane. Gram-, endotossina:

Possono esserci endotossine libere, es per i frammenti di batteri. Il LPS

interagisce con la membrana cell, si legano ai monociti del sangue,

si legano a un recettore specifico, a quel punto parte un pathway

infiammatorio che attiva un infiammasoma NF-kB. Questo provoca la

produzione di TNF-alpha e interleuchine come IL-1beta, che attivano i

macrofagi, sono mediatori della flogosi cioè lo stato infiammatorio e

vanno ad alterare la permeabilità capillare, le cell endoteliali non

hanno più delle giunzioni tight, espongono la lamina basale col collagene

al sangue e iniziano ad attaccarsi le piastrine sull endotelio e di globuli

bianchi, quindi microcoaguli. C è anche IL8 e IL6 come

proinfiammatori, che stimolano la produzione di TNFalpha e IL1beta. Il

legame LPS e recettore porta anche alla produzione di ossido nitrico,

che si accumula e richiama cell infiammatorie a livello polmonare e

quindi danneggia l endotelio polmonare. Quindi parte un processo

infiammatorio sistemico. Ecc.

Non è così raro come sembra.

I gram- sono insensibili ad alcuni tipi di antibiotico. Sia gram+ che

gram- si difendono con i peptidoglicani, quindi si potrebbe

destabilizzare quella barriera per distruggerli, ma i gram- hanno anche l

outer membrane, quindi gli antibiotici riescono a superare la parete cell

ma non l outermembr quindi non raggiunge il target.

Il primo antibiotico scoperto era la penicillina, interrompe la

produzione di peptidoglicani della parete qunidi i batteri diventano

+permeabili a sostanze che possono uccidere il batterio, vale per i

gram+ ma non per i gram-.

Un altro gruppo sono le polimixine, che sono molecole dotate di un

acido grasso con cui possono infilarsi nella membrana dei batteri,

causano delle alterazioni zone in cui la membrana ha ondulazioni

deformazioni evidenti, quindi alterazione della permeabilità, la cell

introduce delle sostanze che dovrebbe tenere fuori, quindi si altera il

metabolismo e il batterio va in lisi. Agiscono sulle cell batteriche ma

anche sulle nostre, quindi effetti neuro e nefro tossici. Va bene per i

gram-.

Ci sono antibiotici che agiscono sulla sintesi proteica, ovvero la

streptomicina e le tetracicline, xno batt gram-/+. Infatti la penstrep

ovvero penicillina+streptomicina è un cocktail antibiotico usato nelle

colture cell per evitare contaminazioni batteriche.

Ci sono anche degli antibiotici che agiscono sulla sintesi degli acidi

nucleici, ma

hanno effetti anche sulle cell eucariote, compromettono la capacità

di duplicazione del batterio.

La polimixina B, è molto efficace sui gram- perché ha capacità anti-

endotossiniche perché si lega in modo stabile al LPS e quindi lo

inattiva, ma ha effetti neurotossico e nefrotossici.

Terapia antiendotossinica basata su cartuccia assorbente con polimixina

B

Non si può assumere per bocca o per cute, l assunzione a livello

sistemico per bocca aveva provocato anche casi gravi quindi no. Idea di

sfruttare la polimixina B in forma extracorporea, che è un po invasivo,

per pazienti in sepsi. Hanno prodotto delle cartucce di assorbimento

dei LPS basata sulla polimixina B. È una terapia antibiotica

esterna. Preleviamo il sangue dalla vena femorale, circuito collegato a

pompa che lo preleva e lo convoglia alla cartuccia assorbente nel

tessuto che ha il

farmaco, qunidi i LPS si legano alle polimixine, così da uscire

ripulito. Si usano anticoagulanti per la circolazione esterna. Poi un

collettore riraccoglie il sangue che rientra.

Nella cartuccia c è una fibra assorbente in maglia, fibra tessuta a

maglia. Ogni filo è fatta da 2 componenti di fibre +sottili. Queste fibre

espongono il polistirene, che espone atomi di cloro che si legano al

gruppo amminico della polimixina in modo covalente.

La fibra è sintetica, per una parte in polistirene e per l altra in

polipropilene, polistirene con all interno rinforzo di fibre in

polipropilene, mare e isole.

La polimixina B è un decapeptide ciclico, ricco di un acido diammino-

butirrico detto Dab, 7 aa in cerchio + 3 in coda + MOA che è una

catena idrocarburica. Quindi è molto piccola. I dab sono 6 e portano

car +. Fenilalanina ha l anello aromatico quindi è apolare, anche il

triptofano, anceh la leucina, quindi 4 aa apolari.

La polimixina in realtà ha una strutt 3d. Da una parte ci sono gli aa

carichi+, dall altra ci sono gli aa idrofobici. Il lipide A ha le due car

neg dei gruppi fosfato da un lato e le cat idrofobiche dall altro, e le

distanze tra due punti carichi (tra i due baricentri delle cariche) sono

simili tra lipide A e PMD.

La stabilità forte tra polimixina e LPS: LPS ha car -, la polimixina

ha aa+. Quindi una delle interazioni che guida la formazione di questo

complesso è ionica. In più hanno una componente idrofobica.

Voglio vedere la forza di leg polimixina-LPS e la forza di

trascinamento dovuta alla velocità del sangue, per confrontarle.

Voglio vedere se le polimixine riescono a catturare LPS e fino a che

distanza.

Modello macro-scala: fluidodinamica, studio con meccanica del

continuo, devo calcolare la velocità max raggiunta dal sangue. Mod a

meso-scala: sempre meccanica del continuo, calcolo lo shear

stress. Mod micro-scala: studio con particle dinamics, le particelle

sono i LPS che si muovono a causa della forza di trascinamento e viene

attirato dalle polimixine. Dal modello alla nano-scala passo le forze

molecolari con la dinamica molecolare. Noi guardiamo la scala

molecolare.

Legame ionico tra cariche, forze di vdw tra idrofobici.

L interfacciamento LPS e polimixina è possibile in due modi, con due

diversi orientameti.

S-LPS vuol dire che è rappresentato intero.

Oltre al LPS completo esiste una forma incompleta ridotta minima che

mantiene l effetto tossico, cioè lipide A + due gruppi saccaridici.

Il problema si può studiare con simulazioni di minimizzazione

energetica. Si fa minimizzare l energia delle singole molecole, del

LPS e della polimixina. Poi faccio la minimizzazione di energia del

sistema LPS+polimixina.

Considero l acqua con metodo implicito cioè uso la costante

dielettrica dell acqua (78).

L energia di interazione tra due molecole al variare della distanza è il

modello alla vdw ovvero il potenziale di lennard-jones. Energia di

interazione polimixina-LPS. Due termini, uno attrattivo e uno repulsivo.

Quando l energia è zero il raggio lo chiamo sigma, rappresenta il raggio

della sfera equivalente al complesso come fosse un atomo rigido. Epsilon

è l energia al minimo.

Voglio determinare l E di interazione LPS-PM.

Questo è il force-field. Faccio sta cosa per LPS e per la PM

singolarmente. Poi lo faccio per il complesso LPS+PM.

Devo fare questa cosa per ogni distanza, per ogni variazione delta della

distanza. Avrò delle coppie di dati (r, E int). E li interpolo con una

curva di lennard-jones.

Force-field amber molto bene per proteine.

Quando si lavora con due molecole, si lascia la prima fissa e l altra in

movimento e poi tutte due in movimento.

Si parte da una distanza di partenza e poi le molecole vengono

spostate di mezzo angstrom per volta.

Devo plottare il raggio come distanza tra i baricentri finali, cioè dopo

che si sono adattate quando le lascio muoversi fissando la distanza cioè

ad ogni r che fisso le molecole possono muoversi per rotazione per

adattarsi al force-field che sentono e quindi modificare il proprio

baricentro, quindi io fisso r poi lascio che si muovano per sistemarsi poi

trovo i baricentri e calcolo la nuova r tra essi e quella plotto nel grafico.

Le forze sono molto elevate, 2 nN di media. Nel complesso antigene-

anticorpo è quasi 1 nN.

Con molecole vicine le forze elevate sono prevalentemente vdW.

Quando sono lontane, la forza scende e la forza prevalente è quella

elettrostatica.

Devo anceh dare la dimensione delle particelle, cioè il raggio della

sfera equivalente al complesso. Si calcola il volume della molecola e

poi si calcola il raggio della sfera equivalente. Questi sono i parametri

da passare al modello successivo = alla micro-scala.

Per ora abbiamo identificato qual è la forza di

attrazione tra polimixine e LPS, cioè abbiamo visto il

problema alla microscala. Ora dobbiamo andare alla

meso e macro scala. Il modello a macroscala

permette di valutare qual è la velocità max

raggiunta dal sangue all interno della cartuccia e

dove viene raggiunta, attraverso considerazioni di

tipo fluidodinamico sul pattern del flusso. Questa

v rappresenta il caso peggiore di sforzo di

taglio applicato alla superficie. Questa velocità

sarà il parametro di ingresso del modello a

mesoscala.

La cartuccia è un oggetto in plastica contenente il mat assorbente,

una sorta di porta rotolo. È un sistema con un condotto d ingresso e

uno d uscita alle estremità. C è un elemento distributore centrale

che si riempie e distribuisce il sangue. Il sangue passa attraverso il

distributore e attraversa poi la regione assorbente che lo circonda,

viene poi raccolto ai lati da un apposito collettore, che poi lo conduce al

condotto d uscita. Struttura assial-simmetrica, quindi posso

rappresentarne solo una regione tipo ¼