Basi di Diagnostica di Laboratorio

Basi di diagnostica di laboratorio

I campioni biologici possono essere vari (sangue, urine, feci, cellule, tessuti, espettorati, liquor, liquido amniotico, ecc.) e vanno trattati in modo differenziato a seconda del tipo di analisi che si deve eseguire. Dal momento in cui si fa il prelievo al momento in cui il campione verrà dosato bisogna eseguire delle procedure accurate. Il trasporto deve avvenire in modo idoneo. L'accettazione e la verifica dell’idoneità sono molto importanti. È importante verificare la validità del campione perché se non fosse idoneo, il risultato sarebbe inattendibile.

Sieratura e centrifugazione

NB: differenza plasma/siero. Plasma, liquido giallastro che si ottiene dopo eliminazione della parte corpuscolata (globuli rossi, bianchi e piastrine) ed è necessario l’anticoagulante. Il siero è il plasma senza fibrinogeno (non serve l’anticoagulante). Il siero si ottiene lasciando coagulare il sangue e poi si centrifuga.

Smistamento ai settori analitici

Quando arriva la provetta madre, da questa si originano altre a concentrazione minore che poi vanno ai vari settori analitici (si chiamano aliquote). Nel caso, è necessario separare le proteine o altri trattamenti a seconda dell’analisi da effettuare; poi è importante la conservazione del campione; molto spesso un campione deve essere analizzato più volte.

Anticoagulanti più utilizzati per plasma

• Litio eparina EDTA: chelante che rimuove ioni Ca²⁺
• Sodio eparina Fluoruro: compete col calcio plasmatico
• L’eparina è un anticoagulante naturale, è Citrato di sodio tribasico e l’ossalato diprodotto anche dal nostro organismo ed è potassio che formano dei complessi poco utilizzato anche come farmaco. Agisce legandosi a solubili con il calcio²⁺

Fattori della coagulazione

Perché il Ca è fondamentale nella coagulazione: Piccola parentesi sulla coagulazione: abbiamo via intrinseca ed estrinseca che si uniscono nella via finale comune rappresentata dal fattore X attivato. Questo fattore in presenza del F5 attivato, trasforma la protrombina in trombina; questa trasformerà il fibrinogeno in fibrina e poi nel momento in cui interviene il fattore 13 attivato, viene a stabilizzarsi il coagulo di fibrina.

L’estremità amminoterminale della protrombina presenta una sequenza di glutammati (amminoacidi polari carichi negativamente), questi sono dei bassi chelanti del Ca²⁺; ma interviene una reazione enzimatica che richiede la Vitamina K, che trasforma i glutammati in Gamma-carbossi glutammato che è un grande chelante del Ca²⁺. Questo permette alla protrombina di andarsi a legare a ciò che resta delle membrane piastriniche. (Il Ca si interpone tra la protombina e le membrane plasmatiche delle piastrine).

È importante che la protrombina vada a contatto con le membrane delle piastrine perché qui ci sono il F10 e F5 attivato che portano all’idrolisi della protrombina, al distacco dell’estremità amminoterminale che rimane attaccata alle piastrine facendo sì che la trombina sia libera di muoversi. A questo punto, incontra il fibrinogeno, lo trasforma in fibrina ed ecco che la fibrina viene stabilizzata dal F13 attivato.

Possibili cause di variazioni pre-analitiche

Nella raccolta del materiale ci può essere la contaminazione o il metabolismo che magari è troppo elevato (inserimento inibitori metabolici o raffreddamento). Nel trasporto bisogna evitare l’emolisi e l’inattivazione (riscaldamento, esposizione alla luce). Nella distribuzione è fondamentale identificare i campioni, evitare la precipitazione e la flottazione (mescolare il campione se necessario).

Per la conservazione bisogna evitare l’evaporazione, la precipitazione, assorbimento (cioè che la molecola che dobbiamo valutare aderisca alla parete della provetta).

Prelievo, raccolta e conservazione di materiali biologici

La natura delle modificazioni pre-analitiche può essere:

• Chimico-Fisica: la fotolisi è un processo nel quale la luce va a degradare una molecola; la denaturazione è un processo nel quale avviene la rottura dei ponti a idrogeno delle proteine (NB: i legami peptidici non si rompono!)
• Biochimica: alterazione dell’omeostasi (equilibrio chimico-fisico presente all’interno di ogni cellula); è anche importante che non vadano a rompersi le membrane che delimitano gli organuli perché altrimenti si libererebbero delle sostanze che possono alterare l’analisi.

Conservazione di materiali biologici

Vanno scelte le opportune condizioni chimico-fisiche per il mantenimento dei campioni biologici:

• Liofilizzazione: modo per conservare delle sostanze deperibili attraverso l’utilizzo del vuoto e del freddo.
• Modifiche del pH: rallentamento enzimi
• Crioprotettori: sostanze che proteggono le cellule quando vengono congelate.

Temperatura di conservazione

• T° ambiente: il campione si può tenere al massimo per 4h
• 4°C: se il campione deve essere dosato max 24-36h
• 0°C: essenziale per ormoni e metaboliti a vita breve
• -20°C o -80°C o azoto liquido a -142°C: da 7 giorni fino ad anni!

Attenzione allo scongelamento perché i cicli ripetuti di congelamento e scongelamento, danneggiando irreversibilmente il campione biologico (distruzione delle molecole!). Allora se uno dovesse dosare lo stesso campione per 10 volte a distanza di 1 mese l’uno dall’altro come posso fare senza cicli ripetuti? Si fanno delle suddivisioni in aliquote e poi si congelano. All’occorrenza si usa una aliquota.

Variabilità analitica

In un laboratorio si punta all’attendibilità; ci devono essere dei metodi attendibili che danno risultati attendibili. Lo scopo di qualsiasi misura è quello di ottenere un risultato il più possibile vicino a quello reale!

L’attendibilità dipende da 4 fattori:

• Precisione: Viene definita come la concordanza fra i risultati di una serie di misure distinte (repliche) ottenute con lo stesso metodo su uno stesso campione. Se abbiamo un campione e lo dosiamo 10 volte, con tutta probabilità avremo 10 risultati diversi. Più sono vicini gli uni agli altri, più siamo stati precisi. C’è un modo per quantificare la precisione: deviazione standard (imprecisione o variabilità analitica). È possibile graficare l’imprecisione, si ottiene una curva a campana. Più la curva è stretta, più abbiamo avuto risultati vicini gli uni agli altri, quindi siamo stati precisi.
• Accuratezza: In una serie di repliche della stessa analisi, essa è il grado di concordanza tra il valore medio trovato ed il valore vero. L’inaccuratezza viene calcolata come differenza tra il valore medio sperimentale ed il valore vero. Una volta dosato il campione 10 volte (sempre seguendo l’esempio), si fa la media dei valori. Confrontiamo questa col valore reale (noi dobbiamo conoscere la concentrazione del campione). Quanto più il valore reale è vicino a quello medio, tanto più il dosaggio è stato accurato. Quindi l’inaccuratezza viene calcolata come la differenza tra il valore medio sperimentale ed il valore vero.
• Specificità: proprietà del metodo di dosare solo la sostanza studiata senza subire interferenze positive o negative. Non ha valore numerico. Se abbiamo una soluzione in cui vi è la sostanza che dobbiamo dosare, ma vi è anche una sostanza terza che interferisce con il metodo, cosa facciamo? Isolare la sostanza da dosare o cambiare metodo.
• Sensibilità: attitudine del metodo a dosare piccole quantità del campione studiato, no valore numerico. Allora si parla di limite di rilevabilità che è la più piccola quantità di sostanza che il metodo riesce a dosare con un limite fiduciario del 95%. Definito anche come rapporto tra il segnale analitico ed il rumore di fondo. (nello spettrofotometro c’è una linea di base e quando lo strumento riesce a determinare la presenza di una sostanza, si forma un picco ed in base all’area in cui si forma, si riesce a risalire alla concentrazione della sostanza; più piccola sarà la concentrazione, maggiore sarà la sensibilità dello strumento).

Limiti fiduciari

Per un risultato isolato x ottenuto con un metodo di cui si sia calcolata la DS (deviazione standard) su almeno 25 dati sperimentali, i valori x ± 2DS sono chiamati in termini statistici limiti fiduciari (di confidenza del risultato). Essi sono i limiti di concentrazione entro i quali si può avere “fiducia” che sia compresa la concentrazione “vera” della sostanza (con una probabilità del 95,5%).

(Immaginiamo di avere un campione, dosarlo 25 volte, fare la media e questa + la deviazione standard per trovare il valore centrale; questo si intende per limite fiduciario). Immaginiamo di avere un campione, di dosarlo 25 volte, fare la media; poi fare la media ± 2DS si crea un range e in questo range c’è la probabilità del 95.5% di trovare il valore reale. Si parla di errori totali perché si tratta di un insieme di errori di varia causa (più specificatamente errori sistematici ed errori casuali). L’errore totale è la differenza tra il valore vero e quello ottenuto con il procedimento analitico.

Classificazione degli errori di misura

• Errori sistematici: falsano il risultato dei risultati analitici, si ripetono in maniera sistematica quando uno usa quel determinato metodo. Le cause sono note e possono essere: scarsa sensibilità o una scarsa specificità del mezzo oppure il metodo è giusto, ma viene svolto in maniera inaccurata.
• Errori casuali: sono inevitabili, non si possono eliminare completamente. Le cause sono varie; sono dovuti in genere o all’analista, o alle condizioni operative o ad entrambe le situazioni. Valore vero e valore misurato (media dei valori ottenuti); la differenza tra questi corrisponde all’errore sistematico che corrisponde all’inaccuratezza. L’errore casuale fa riferimento all’imprecisione.

L’errore totale dipende da entrambi questi errori, però abbiamo anche l’errore grossolano, cioè degli errori che possono essere accidentali e sono dovuti generalmente all’operatore, sono facilmente evitabili, in ogni caso vanno eliminati.

Errore totale

• A = variazione della misura effettuata nella stessa serie (precisione entro la serie);
• B = variazione da un giorno all’altro, ottenuta da uno stesso operatore su uno stesso campione (precisione fra le serie);
• C = variazione tra operatori dello stesso laboratorio che eseguono la stessa analisi su campioni identici (precisione intra-laboratorio);
• D = variazione fra laboratori diversi (precisione inter-laboratorio).

Coefficiente di variazione (CV)

Sappiamo che per verificare l’imprecisione utilizziamo la deviazione standard, questa risente anche se in maniera non proporzionale, della concentrazione del campione. (Maggiore è la concentrazione, maggiore è la deviazione standard) conviene utilizzare il CV, che corrisponde al rapporto tra la DS e la media dei risultati ottenuti per quel campione, per 100. Il CV rispecchia più fedelmente l’imprecisione dell’esecuzione analitica, comprendendo sia il valore medio x, sia la DS.

Limiti di accettabilità di errore

Immaginiamo di avere degli analiti a concentrazione non nota da dover dosare; come possiamo verificare l’accuratezza dei dosaggi? Dobbiamo aggiungere a questa serie di analiti, dei campioni a concentrazione nota. Per semplicità ne utilizziamo uno, lo dosiamo più volte e poi facciamo la media; confrontiamo la media del valore ottenuto con quello reale; la differenza non deve andare oltre un certo limite che è collegato al CV.

Deviazione percentuale

Si definisce il rapporto tra la differenza tra valore reale (μ) e valore trovato (x=media dei valori ottenuti) ed il valore reale, per 100: questa percentuale deve essere confrontata col triplo della espressa come deviazione percentuale. La deviazione percentuale deve essere inferiore a 3 volte il CV. Se è così vuol dire che i dosaggi sono accettabilmente accurati (xk stiamo misurando l’accuratezza dei dosaggi).

Esempio di controllo dei metodi in laboratorio di diagnostica

Media dei valori ottenuti = x Valore reale = μ Il dosaggio non è sufficientemente accurato!

Controllo dei metodi in laboratorio di diagnostica

• Accurato
• Preciso
• Di facile applicazione

I metodi analitici devono essere scelti in funzione dell’accuratezza, della precisione e della facilità di esecuzione. Ogni metodo deve essere descritto in modo dettagliato e riportare le seguenti indicazioni:

• Riferimenti bibliografici essenziali;
• Principio del metodo (cosa richiede);
• Reagenti e soluzioni con modalità di conservazione delle stesse;
• Procedimento;
• Calcolo dei risultati con significato delle costanti impiegate;
• Limiti di riferimento dei valori normali;
• Eventuali ulteriori annotazioni per es. relative ad interferenze da parte di sostanze biologiche o farmacologiche.

Controllo di un nuovo metodo

Generalmente viene eseguito dall’autore che lo propone. Comunque, prima di introdurre un nuovo metodo, vanno effettuati i seguenti controlli:

• Controllo della precisione;
• Controllo della accuratezza (prove di aggiunta standard interno, confronto con metodi di riferimento, ecc.);
• Controllo della linearità di risposta;
• Controllo della stabilità dei reagenti;
• Determinazione dei valori normali.

I metodi vengono classificati in base all’accuratezza; questa viene misurata andando a fare l’analisi comparativa di due valori presi dallo stesso campione. I due valori vengono ottenuti con il metodo candidato e l’altro con un metodo di comparazione che idealmente dovrebbe dare il valore vero. Secondo il loro grado di accuratezza, i metodi analitici possono essere classificati in quattro tipi:

1. Metodo definitivo: è un metodo che non ha fonti di inaccuratezza o ambiguità. Esso dà un risultato definitivo che costituisce la migliore approssimazione del valore vero.
2. Metodo di riferimento: è un metodo che ha un’inaccuratezza trascurabile. (si punta a questo)
3. Metodo ad errore noto: è un metodo in cui è stata stabilita l’entità dell’errore. Se i risultati vengono corretti per l’errore è necessario che questo sia dichiarato.
4. Metodo ad errore ignoto: è un metodo ad accuratezza ignota, esso dà un risultato inattendibile.

I metodi devono essere confrontati; grafico → ascisse valori del metodo nuovo, ordinate del metodo attuale. Poi si dosano più campioni con i 2 metodi. Bisogna vedere la correlazione tra i due metodi. Quanto più i valori si avvicinano alla retta, maggiore sarà la correlazione tra i due metodi.

Per studiare la correlazione si applica una equazione: R=coefficiente di correlazione

Aumento della specificità di un metodo

L’aumento della specificità si può ottenere con la separazione dell’analita da analizzare. Questa separazione si può fare con:

• Solventi,
• Elettroforesi (metodo che permette di spostare e rimuovere le molecole in base alla loro carica),
• Isoelettrofocusing (separa in base al punto isoelettrico cioè il pH della soluzione in cui la molecola ha carica tot=0),
• Deproteinizzazione, ecc.

Oppure altri metodi che sono a “selettività secondaria”:

1. Sulla selettività di particolari reazioni (reazioni specifiche colorimetriche [reazioni in cui la molecola si fa reagire con una determinata sostanza e questo porta ad un cambiamento di colore della molecola; l’intensità del colore è direttamente proporzionale alla concentrazione dell’analita] o fluorimetriche [sostanze che eccitate ad una determinata lunghezza d’onda, emettono una fluorescenza ad una lunghezza d’onda maggiore]),
2. Sulla selettività di lettura del segnale (lunghezza d’onda o tempo [ci sono sostanze che assorbono ad una determinata lunghezza d’onda; misurando questa lunghezza d’onda possiamo risalire alla concentrazione dell’analita]),
3. Sull’impiego di metodi diretti a specificità molto elevata (reazioni enzimatiche per misurare substrati),
4. Sull’uso di tecniche separative e di misura strettamente accoppiate.

La sicurezza della qualità nel laboratorio

Il controllo interno di qualità rappresenta il controllo dell’attendibilità di un metodo analitico, esso consente di scoprire e quantificare gli errori analitici del laboratorio stesso ed eventualmente di minimizzarli. Per eseguire il controllo interno di qualità, bisogna disporre di un “materiale di controllo” (campione o siero di controllo). Le caratteristiche del campione di controllo devono essere:

• Omogeneità,
• Stabilità nel tempo,
• Composizione chimico-fisica il più possibile vicina a quella dei campioni in esame;

I campioni di controllo devono essere analizzati nella stessa serie (perché devono essere fatti nelle stesse condizioni) dei campioni in esame ed in maniera anonima (perché sennò si può influenzare il risultato).