Basi di Diagnostica di Laboratorio

FASI DELLA PCR

Tre passaggi amplificati per 30 o 40 cicli:

• a 95°C, 30 sec. - 1 min • DENATURAZIONE
• a 54-60°C, 30 sec. - 50 sec • ANNEALING
• a 72°C, 1-2 min • ESTENSIONE (interviene la TAQ POLIMERASI che sintetizza a 72°C)

Se abbiamo una singola molecola di DNA, in meno di 2h si termina la PCR.

LA NATURA ESPONENZIALE DELLA PCR

Per avere un'idea di come aumenti il numero di molecole: il 1° ciclo ne forma 2, il 2° ne forma 4, il 3° ne forma 8. Si utilizza una formula:

N = numero di molecole finali di DNA

NO = numero di molecole iniziali di DNA presenti

E = efficienza della reazione (fra 0 e 1)

n = numero di cicli

LA SCELTA DEI PRIMER

Hanno una lunghezza da 20 a 29 basi, ed una percentuale di G+C compresa tra il 40% e il 60%, la loro sequenza deve essere priva di omologie interne (perché se ci sono, il DNA può richiudersi su sé stesso formando delle doppie eliche che impediscono la sintesi chimica).

l’attività del primer) Facendo conto che questo sia il primer (la barretta verdina), i nucleotidi saranno attaccati dalla TAQ-P all’estremità 3’. Un cattivo appaiamento sul 3’ impedirebbe l’amplificazione, invece un cattivo appaiamento sul 5’ non influenza perché l’amplificazione va da sinistra verso destra. (i nucleotidi si attaccano all’estremità 3’ dello zucchero dell’ultimo nucleotide del primer) IL DISEGNO DEL PRIMER: I primer si inseriscono all’estremità 3’ e vediamo che il primer avrà direzione 5’-3’ così 5’-3’. Quindi, per poter utilizzare la PCR bisogna conoscere la sequenza nucleotidica delle due sequenze in modo tale da poter legare i primer e poi far intervenire la TAQ POLIMERASI. I primer sono lunghi circa 20-25 coppie di basi. GLI STRUMENTI: Il thermal cycler (termociclizzatore) permette di ottenere con grande precisione e omogeneità le variazioni di temperatura necessarie per la PCR.

temperature necessarie al compimento della reazione ciclica di PCR; esistono strumenti che automatizzano la fase di estrazione, allestimento ed esecuzione dell'amplificazione, senza intervento esterno e con ridotti rischi di contaminazione da parte dei prodotti di amplificazione. Cioè preparano il DNA alla PCR. Presenti solo nelle ASL o cmq nelle grandi aziende.

VERIFICA IL RISULTATO DELLA PCR:

Avviene attraverso:

• L'analisi della lunghezza dei frammenti amplificati mediante gel elettroforetico e colorazione con bromuro di etidio (colorante DNA che se si eccita con luce UV, emette fluorescenza e il colore è 20 volte più evidente se si inserisce all'interno della doppia elica del DNA; il colorante è carico positivamente, quindi va verso il polo negativo. Lo svantaggio è che è cancerogeno!)
• L'analisi di restrizione con specifiche endonucleasi
• L'ibridizzazione con sonde marcate (Southern blotting)

SOUTHERN BLOTTING

(Southern da colui che la individuò) Tecnica che permette di identificare un frammento di restrizione contenente una sequenza di base specifica ibridizzandolo con un filamento marcato di DNA complementare. Cioè se noi vogliamo verificare se c'è davvero quel DNA, dobbiamo avere a disposizione un filamento complementare ad esso, MARCATO. In modo tale che se c'è questo DNA, si formi un ibrido e questo può essere evidenziato.

[Esiste anche il NORTHERN BLOTTING, così nominato per associare una tecnica molto simile alla SOUTHERN, che però identifica l'RNA e non il DNA.]

[C'è anche il WESTERN BLOTTING, tecnica che permette di individuare una proteina all'interno di una miscela proteica. Si usa un anticorpo marcato con un enzima. Si forma il complesso Ag-Ac, poi si aggiunge il substrato per l'enzima e si crea la chemioluminescenza che è visualizzabile.]

Immaginiamo di aver amplificato una molecola di

200 coppie di basi. Se questa ha una sequenza riconosciuta da questo enzima di restrizione (EcoRI) o anche un'altra sequenza riconosciuta da un altro enzima di restrizione (HindIII), possiamo tagliare questo DNA in frammenti e poi fare correre i frammenti.

Se usiamo EcoRI dovremmo ottenere 2 frammenti di 110 e di 90 coppie di basi. Se usiamo HindIII dovremmo ottenere un frammento da 160 coppie di basi e uno da 40.

A sx abbiamo gli standard.

APPLICAZIONI DELLA PCR:

Applicazione analitica:

• identificazione della presenza / assenza di determinate sequenze geniche nel campione in esame (es. identificazione di genomi virali).

Applicazione preparativa:

• il campione amplificato viene utilizzato come bersaglio per ulteriori tecniche di biologia molecolare (es. può essere sequenziato, ibridato con specifiche sonde, sottoposto ad enzimi di restrizione, a screening per la ricerca di mutazioni, ecc).

La PCR è diventata di uso corrente per:

• la diagnosi di infezioni batteriche e virali.

diagnosi cliniche di malattie causate da mutazioni,

la diagnosi prenatale per l'emofilia,

il controllo dell'efficacia di terapie anti-tumorali,

la determinazione del sesso,

gli studi di evoluzione molecolare.

RT-PCR

Reverse transcriptase-polymerase chain reaction

Trascrittasi inversa: enzima tipico dei retrovirus (virus a singolo filamento di RNA); quando questi virus infettano un eucariote lasciano il capside all'esterno, entra il filamento di RNA assieme alla TI; a questo punto ha 3 azioni:

• sintesi di DNA complementare all'RNA
• degradazione dell'RNA stampo
• sintesi DNA complementare a quello appena sintetizzato

poi questo DNA a doppia elica va ad integrare a caso nel genoma dell'ospite rimanendo quiescente finché non c'è qualche alterazione che porta ad un suo "risveglio"

Questo enzima è usato per studiare l'espressione genica (quanto gene viene trascritto in mRNA).

La tecnica della RT-PCR

è una variante della tecnica della PCR, che consente di amplificare una molecola di DNA partendo da un insieme di RNA totali estratti da un tipo cellulare;

la RT-PCR viene sfruttata in laboratorio per studiare l'espressione genica, essa prevede lo svolgimento di due fasi:

• Retrotrascrizione dell'RNA,
• Amplificazione del cDNA (DNA complementare) ottenuto nella prima fase.

Si parte da cellula/tessuto e si recupera l'RNA.

Aggiunta di un cappuccio all'estremità 5' (posizione correttamente l'mRNA sul ribosoma), eliminazione degli introni e aggiunta di una coda di poliadenosine ad estremità 3' (proteggono l'mRNA quando passa attraverso i pori nucleari).

È importante questa coda di poliadenosine perché permette di creare il PRIMER che poi consente la trascrizione.

L'obiettivo è SINTESI DI cDNA. Potremmo utilizzare PRIMER formato da oligodeossiTimidine perché saranno complementari alle adenosine.

ed ecco che si può sintetizzare un filamento. All'estremità 3' abbiamo la coda di poliadenosine. Quindi si può formare l'ibrido. Poi aumentando la basicità dell'ambiente, si elimina l'RNA e poi si sintetizza il DNA complementare a quello prodotto dalla TI. E poi si arriva all'amplificazione con la PCR. Avremo quindi tanti cDNA di cui poter studiare l'espressione genica che partono tutti dall'mRNA iniziale. Quindi vedere quali geni in quel tessuto vengono espressi. REAL TIME PCR è anche essa una tecnica molto sensibile (cioè è sufficiente una singola molecola di DNA per amplificarlo), ma si differenzia dalla PCR normale perché la QUANTIFICAZIONE di una specifica sequenza di acido nucleico. Capiamo che il DNA viene amplificato perché si forma fluorescenza; quanto più DNA viene amplificato, tanta più fluorescenza viene prodotta. Possiamo verificare che venga amplificato.

Proprio il segmento che vogliamo in tempo reale (cioè man mano che i cicli si succedono!). La quantificazione di DNA, cDNA o RNA ha luogo determinando il ciclo nel quale il prodotto di PCR può essere rivelato per la prima volta. Cioè, la quantificazione del DNA è possibile rilevando il ciclo di amplificazione in cui la fluorescenza si evidenzia per la prima volta; dobbiamo immaginare che man mano che i cicli procedono la fluorescenza aumenta, però all'inizio questa è talmente bassa che non viene rilevata dal detector. Ad un certo punto, arriva un ciclo detto "CICLO SOGLIA" nel quale per la prima volta la fluorescenza viene rilevata. In questo modo possiamo risalire a quanto DNA è stato prodotto fino a quel momento e a quanto DNA era presente in partenza (perché più DNA era presente in partenza, minore sarà il numero di cicli necessario per raggiungere il ciclo soglia). È quindi differente dalla PCR "classica".

della freccia) che viene denaturato a 95°C. Successivamente, le due eliche si riassociano a 60°C e si allungano a 72°C. Durante questa fase di allungamento, il SYBR Green si inserisce nella doppia elica e emette fluorescenza. La quantità di fluorescenza emessa è proporzionale alla quantità di DNA presente nel campione iniziale. La PCR viene eseguita in cicli ripetuti, con un aumento esponenziale del DNA target. La quantità di fluorescenza viene misurata ad ogni ciclo e viene rappresentata in un grafico chiamato curva di amplificazione. La presenza di un picco nella curva di amplificazione indica la presenza del DNA target nel campione iniziale.5’-3’), un primer (complementare alla sequenza), colorante (in questo caso colorante SYBR Green) che si localizzano nella doppia elica. La rivelazione avviene nel passaggio di estensione della PCR, l’intensità del segnale aumenta nei cicli successivi, a causa dell’accumularsi dei prodotti della PCR. Si utilizza una molecola fluorescente NON SPECIFICA (punto debole!!) che si lega al solco minore del DNA. VANTAGGI: - Costo minore (costa meno di una sonda che deve essere sintetizzata appositamente) - Può amplificare prodotti non specifici - Si inserisce il colorante all’interno e viene evidenziata la fluorescenza! SVANTAGGI: - Bisogna sempre andare a verificare l'analisi di numerosi target - Può formare dimeri di primer che si uniscono