Appunti presi a lezione di Immunologia

LEZIONE 1→ ematopoiesi

L’immunologia è lo studio del sistema immunitario, un insieme di molecole, cellule, tessuti e

organi fondamentali per diversi scopi, il cui principale è la protezione da parte delle infezioni.

Si attiva per confinarle e quando possibile eliminarle.

Altre funzioni sono: la protezione dai tumori, il mantenimento dell'omeostasi dei tessuti e la

loro riparazione qualora siano danneggiati.

Come si attiva la risposta immunitaria? è una risposta coordinata delle varie componenti del

sistema immunitario che contrasta una potenziale minaccia alla salute dell'organismo.

Tutte le cellule del sistema immunitario si generano dalle staminali ematopoietiche

presenti nel midollo spinale osseo.

Ematopoiesi = dal greco αίμα (sangue) e ποιὲω (creare)

E’ il processo di produzione del sangue, tessuto connettivo specializzato la cui funzione

principale è trasportare ossigeno e nutrienti ai tessuti.

Sottoponendo il sangue ad una centrifuga otteniamo 2 frazioni:

-​ liquida: plasma composto principalmente da acqua in cui sono disciolti microelementi

-​ componente corpuscolata: 45%, frazione prodotta ogni ogni giorno in cui sono

presenti tipi cellulari distinti: nei mammiferi se ne evidenziano 8/9:

1.​ linfociti T

2.​ linfociti B

3.​ monociti

4.​ cellule dendritiche

5.​ neutrofili

6.​ basofili

7.​ eosinofili

8.​ eritrociti

9.​ piastrine (entità

biologica non

definibile come cellula ma come frammento cellulare, poiché sprovvista di

nucleo e organelli; proviene dalla frammentazione della membrana dei

megacariociti.

Tutti questi tipi cellulari possono essere ulteriormente catalogati attraverso una distinzione

che si basa sulle loro caratteristiche morfologiche macroscopiche e microscopiche.

Alcune cellule del sistema immunitario non hanno pigmenti e sono bianche (globuli bianchi o

leucociti); la loro funzione generale è di proteggere l’organismo da tutte le alterazioni che

potrebbe ricevere: patologiche, chimiche, maligne, tossiche. I leucociti si dividono in:

-​ PBMC, che hanno un singolo nucleo di forma tondeggiante

-​ PMN, polimorfonucleati che hanno nucleo singolo multilobato o nuclei multipli

Le cellule rosse (eritrociti) hanno un ruolo trofico perché veicolano i nutrienti alle cellule.

Le piastrine invece hanno il ruolo di creare coagulazioni per stoppare la fuoriuscita di sangue

dalle ferite del derma.

Quindi il sangue è una miscela eterogenea e si rigenera ogni giorno, infatti le sue cellule

hanno una vita abbastanza breve e i loro costituenti vengono riciclati dal corpo.

ipotesi → proliferano… CONFUTATA! sono incapaci di proliferare perchè questa è una

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caratteristica specifica delle cellule non differenziate

ipotesi → provengono dalle cellule staminali (dal latino “stamen”: filo, inteso come il

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principio fondante di ogni cellula). I primi embriologi hanno scoperto che tutta la vita ha

origine da una singola cellula (lo zigote), questa cellula è stata definita come cellula

staminale fondante o totipotente (poiché può creare tutto ciò che l’organismo necessita per

formarsi). Dalla riflessione su questa caratteristica è nata l’idea che anche nell’organismo

adulto esistessero delle cellule staminali, meno potenti, che potessero creare per

differenziazione i tipi cellulari necessari all’organismo durante la sua vita. Queste cellule

sono geneticamente e morfologicamente diverse dalle altre, con funzione di proliferare e

creare tutti i tipi di cellule presenti nel torrente circolatorio del sangue. Caratteristiche:

-​ capacità proliferativa importante

-​ localizzazione: devono essere collocate al di fuori del circolo sanguigno (poiché

nessuna cellula lì presente è capace di proliferare)

-​ self renwals: devono essere in grado di rigenerarsi perché se si differenziassero

tutte, senza rinnovarsi, finirebbero subito

1916: primo anno in cui degli embriologi effettuano una scoperta indiretta per lo studio

dell’immunologia, cioè che nei gemelli eterozigoti di bovino il sistema circolatorio è condiviso

durante tutto lo sviluppo, infatti sono presenti delle strutture che sono punti di collegamento

tra i 2 gemelli; quindi i gemelli durante tutto lo sviluppo embrionale condividono il sangue.

Mantengono però un diverso patrimonio genetico, infatti una mucca in calore potrebbe

essere fecondata da 2 bovini maschio diversi.

1945-1961: Ray Owen scopre che i bovini i gemelli eterozigoti hanno un sangue definito

“chimera”, ovvero un ibrido. Se ne rende conto analizzando il gruppo sanguigno e

accorgendosi che ne è presente più di uno in un singolo individuo.

Durante lo sviluppo embrionale i bovini gemelli hanno condiviso un altro tipo di cellule, oltre

quelle del torrente circolatorio e queste hanno permesso di produrre gli eritrociti del gruppo

sanguigno dell’altro gemello per tutta la durata della sua vita.

Dopo il bombardamento nucleare di Hiroshima e Nagasaki metà della popolazione muore

sul colpo mentre l’altra metà, sottoposta alle radiazioni ionizzanti, sopravvive ma soffre di

una condizione detta “sindrome acuta da radiazioni” e anche da anemia aplastica, che

provoca una drastica riduzione del numero delle cellule del sangue. Questa malattia si

compone nello specifico di 3 diverse carenze: di leucociti (leucopenia), di eritrociti

(eritropenia) e di piastrine (trombocitopenia). Gli effetti di questi abbassamenti sono:

infezioni ricorrenti che causano piaghe, gli individui si ammalano molto più facilmente

➔​ perchè non sono in grado di difendersi dalle minacce/ virus/ batteri

necrosi: i tessuti iniziano a morire

➔​ incapacità di coagulazione quindi dissanguamento ed emofilia

➔​

L’interesse della comunità scientifica si sposta di molto verso lo studio delle radiazioni per

capirne gli effetti sul corpo umano e poi curarli. Vengono effettuati studi per l’anemia

aplastica sui topi e si scopre che basta coprire con piombo il loro fegato e la milza affinché il

topo non sviluppi la sindrome. Da questa informazione si capisce dove sono localizzate le

cellule che sono in grado di riformare il sangue quando viene danneggiato, le staminali.

1951: Lorenz irraggia con una dose letale di radiazioni un animale e poi gli inietta in vena le

cellule prelevate dal midollo osseo di un topo donatore; l’animale, pur non essendo stato

protetto da nessuno scudo di piombo, non sviluppa la sindrome acuta da radiazioni.

Till e McCulloch si rendono conto che quando negli animali vengono iniettate queste cellule

del midollo osseo, queste colonizzano la milza e le colonie (copie multiple di una stessa

entità biologica =cloni) sono ben visibili ad occhio nudo. Le protuberanze sono piene di

cellule del sangue, quindi sono sedi di ematopoiesi. Iniziano a effettuare delle iniezioni diluite

in modo seriale; da questo studio nasce l’ematopoiesi quantitativa (scienza). Più si

diminuisce il numero di cellule iniettate, più diminuisce quello delle colonie che si formano

sulla milza. Iniettando una singola cellula c’è probabilità non nulla che almeno una colonia si

formi. Però sono necessarie 20.000 cellule per creare 2 colonie, 40.000 cellule per 4: vuol

dire che non tutte le cellule del midollo sono cellule staminali. Dal calcolo della probabilità si

deduce che 1 cellula su 10.000 del midollo osseo è una cellula staminale.

LEZIONE 2→cellule staminali e progenitori ematopoietici

Le colonie che scoprono Till e McCulloch sono monoclonali, cioè composte solo da cellule

identiche l’una all’altra. Essi lo dimostrano attraverso le radiazioni: sottoponendole ad una

dose tale da non ucciderle, ma abbastanza potente da indurre una mutazione (rotture al

doppio filamento con conseguenti riarrangiamenti cromosomici) che distrugge l’ematopoiesi

e le marchi inevitabilmente, poiché la mutazione che subisce ogni cellula è unica.

Analizzando poi il cariotipo di tutte le cellule contenute all'interno di ogni colonia si rendono

conto che tutte le cellule di una colonia hanno lo stesso cariotpo, che è diverso da quello

delle altre colonie. Quindi si presuppone che ogni colonia si è generata da una singola

cellula che ha proliferato.

1970 → Iscove scopre che le cellule delle colonie evolvono nel tempo. I ricercatori si

chiedono: è possibile caratterizzare questa eterogeneità? Si può identificare una cellula?

Ci vorrà molto tempo per trovare tutti i marcatori che permetteranno di identificare ciascun

tipo particolare di cellule staminali. Con la scoperta degli anticorpi monoclonali si trova quindi

un modo per marcare le proteine che sono espresse nella membrana delle cellule. Infatti,

ciascuna cellula del nostro organismo, in base alla sua funzione, possiede una serie di

proteine sulla propria membrana, necessarie per la sopravvivenza della cellula e per la sua

funzione. Ad esempio, i neuroni sulla propria membrana plasmatica hanno tantissimi canali

che permettono il passaggio di sodio e potassio, per la generazione del potenziale d'azione;

la cellula dell'epitelio invece, possiede delle proteine che la aiutano a mantenere una forte

adesione con le altre cellule per creare un tessuto barriera.

Molte di queste proteine, per il loro ruolo fondamentale come marcatori che permettono di

identificare un tipo cellulare rispetto all'altro, sono

classificate all'interno di un sistema internazionale di

classificazione che prende il nome di CD (Cluster of

Differentiation).

Ad esempio, il linfocita T ha in membrana 3 particolari

marcatori: CD3, CD4 e CD45. Per identificare un tipo

cellulare non basta un singolo marcatore, ma è la

combinazione di questi che identifica in maniera univoca un tipo cellula.

CD45 è considerato un marcatore di tutte le cellule immunitarie (se noi dimostriamo che la

cellula di nostro interesse esprime CD45 capiamo che quella sia una cellula immunitaria).

Quindi una volta che i ricercatori hanno capito che ciascuna cellula esprime una serie di

proteine sulla membrana, queste possono essere utilizzate per marcare le cellule ed

identificarle, ma non sapevano quali marcatori avessero le cellule staminali ematopoietiche.

Quindi come è possibile scoprire i marcatori che permettano di identificare queste cellule?

In generale, quando si fa un'indagine biologica si utilizzano sempre 2 approcci in parallelo: le

analisi in vitro e in vivo. In un sistema in vitro possiamo semplificare al massimo la nostra

domanda biologica e avere il più alto controllo possibile su tutti i fattori coinvolti

(temperatura, umidità, terreno di coltura…).

Per l’analisi in vitro i ricercatori utilizzarono come metodo quello dei saggi di formazione

delle colonie. Questi partono sempre dall’estrazione di cellule staminali dal midollo, che

vengono analizzate attraverso uno strumento chiamato Cell Sorter e mediante la tecnica del

FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting), cioè separazione delle cellule in base alla

fluorescenza. Si associa a ogni anticorpo un diverso marcatore fluorescente e si indirizzano

gli anticorpi contro i marcatori di cui si vuole analizzare l'espressione.

C117 è un recettore per lo Stem Cell Factor, mentre Sca1 è uno scavenger receptor, cioè un

recettore che le cellule utilizzano per catturare tutto ciò che c’è nell'ambiente circostante e

internalizzarlo, per analizzare quello che succede intorno ad esse.

Facendo reagire le cellule staminali con alcuni anticorpi vediamo se questi marcatori sono

espressi o meno. In questo caso identifichiamo 4 popolazioni.

- una popolazione di cellule del midollo che esprimono entrambi i marcatori,

definite come cellule “c117-positive” e “Sca1-positive”

- un'altra popolazione che è positiva solo a Sca1, ma negativa a c117

- un'altra popolazione che è positiva solo a c117, ma negativa a Sca1

- un’ultima popolazione che è negativa per entrambi i marcati

Dimostrando che questa combinazione di marcatori riesce ad identificare un eterogeneità

all'interno del nostro midollo osseo possiamo quindi dire che questo contiene almeno 4

popolazioni distinte.

Il passaggio successivo è prendere ciascuna di queste popolazioni e diluirla in un terreno

contenente metilcellulosa. Il fattore fondamentale dei saggi è che ogni cellula sia

monodispersa, cioè presente da sola in soluzione. Si diluiscono in metilcellulosa, una forma

di cellulosa modificata con la presenza di un gruppo metile, che serve a renderla ancora più

idroscopica, cioè capace di attrarre più facilmente l'acqua, affinché una volta raffreddata

diventi solida, come un gel. Il terreno quindi solidificandosi intrappola ciascuna cellula

singolarmente e questo viene lasciato in cultura per circa 8-12 giorni. Le cellule, capaci di

proliferare, formano delle colonie. Lo step di analisi finale è quello di analizzare che tipo di

colonie si formano. I ricercatori hanno scoperto che si possono identificare 4 tipi di colonie:

-​ CFU-E (Colony Forming Unit Erythroid), cioè delle colonie formate solo da cellule

eritroidi (eritrociti), si possono distinguere molto chiaramente perché hanno all'interno

delle macchie rosse che indicano la presenza di emoglobina

-​ CFU-M, colonie formate esclusivamente da monociti; le distinguiamo perché sono

completamente bianche

-​ CFU-G, colonie formate esclusivamente da granulociti, che contengono grandi

masse scure, causate dalla degranulazione dei granuli citoplasmatici

-​ colonia mista, ne esistono 2 tipi:

o CFU-GM, che contiene sia monociti che granulociti

o CFU-GEMM(Colony Forming Unit-Granulocyte, Erythrocyte, Monocyte,

Megakaryocyte), che contiene tutti i tipi cellulari del sangue. L’ultima

colonia è stata originata da una vera e propria cellula staminale, poiché in

grado di generare tutti i tipi cellulari del sangue.

Una volta concluso il saggio si può dedurre quali marcatori siano associati alle cellule di

nostro interesse (le CFU-GEMM). Ad esempio, isolando una popolazione che messa in

cultura origina solo colonie di tipo CFU-G, vuol dire che questa cellula rappresenta un

precursore di granulociti. Quindi i ricercatori si rendono conto che il midollo osseo non è

formato solo da cellule staminali, ma sono presenti anche cellule multipotenti, oligopotenti,

capaci di originare pochi tipi cellulari e unipotenti, cioè in grado di originare solamente un

tipo di cellula. Dimostrano che la cellula staminale ematopoietica non origina direttamente

dalla sua stessa proliferazione tutti i tipi cellulari presenti nel sangue, ma prima origina una

serie di progenitori, precursori

intermedi che a loro volta poi

originano le cellule differenziate.

Potenza= capacità differenziativa

I ricercatori osservano anche che

c'è un eterogeneità residua nelle

CFU-GEMM, cioè viene dimostrato

che cellule con marcatori differenti

riescono ugualmente a originare

delle colonie che contengono tutti i

tipi cellulari e si rendono conto che

esistono delle cellule diverse che esprimono marcatori diversi, ma che riescono comunque a

originare tutti i tipi cellulari del sangue. Come è possibile che cellule con marcatori diversi

abbiano la stessa funzione?

Per rispondere a questa domanda non è sufficiente utilizzare l'analisi in vitro dei saggi ma è

necessario utilizzare anche un altro approccio.

In vivo: il secondo tipo fondamentale di saggi che hanno sviluppato i ricercatori sono i saggi

di ricostituzione. Si estraggono sempre le cellule del midollo e si suddividono nelle varie

sottopopolazioni di interesse, nello stesso modo dei saggi in vitro. In questo caso però le

cellule vengono trapiantate in un topo ricevente, sottoposto precedentemente a una dose

letale di radiazioni. Innanzitutto, si osserva se il topo riesce a sopravvivere subito e a

distanza di settimane o mesi si fanno diversi prelievi di sangue per vedere se all'interno sono

presenti o meno tutti i tipi cellulari. A indicazione del fatto che le popolazioni che abbiamo

iniettato sono in grado di produrre tutte le cellule del sangue.

Una piccola declinazione di questo tipo di saggio sono i trapianti seriali, cioè i saggi di

ricostruzione, ma ripetuti per più generazioni di un animale. Questi saggi permettono di

dimostrare la terza e ultima fondamentale proprietà delle cellule staminali, cioè la capacità di

self renewal, di autorinnovarsi.

I ricercatori scoprono che non solo le cellule ematopoietiche possono essere divise in base

alla loro potenza, ma anche in base alla capacità di self renewal e lo dimostrano soprattutto

con i trapianti seriali, perché dimostrano che esistono delle cellule multipotenti, in grado di

rigenerare il sangue solo per periodi di tempo limitati e altre che sono in grado di rigenerare

il sangue per periodi di tempi virtualmente illimitati.

Quindi arrivano a creare il modello gerarchico attualmente accettato dell'emopoiesi, cioè

identificano i marcatori e le caratteristiche di quella che è l'unica cellula staminale

dell'organismo, a cui danno il nome di Long Term Hematopoietic Stem Cell.

Capacità di self renewals che poi viene gradualmente persa nelle cellule staminali short

term, a cui seguono i cosiddetti MPP (Multipotent Primate Progenitor), cioè progenitori

multipotenti, che origina poi dei precursori che, oltre a diminuire ulteriormente la capacità di

self renewal, perdono la caratteristica di multipotenza e diventano così oligopotenti. Si hanno

2 diversi precursori oligopotenti:

- CLP (Common Linfoide Progenitor), progenitore linfoide comune

- CMP (Common Mieloide progenitor), cioè progenitore comune di tutte le cellule

mieloidi, cioè tutti i leucociti, che non solo linfociti.

Quello che si sta attualmente studiando è un particolare pathway molecolare mediato da un

fattore di trascrizio