Appunti Immunologia

Titolo anticorpale del siero

Aggiungere a una serie di provette un egual volume di Ab a diluizione crescente e una quantità costante di Ag corpuscolato. Dopo un periodo di incubazione avviene l'agglutinazione. L'ultima diluizione in cui si osserva l'agglutinazione è definita titolo del siero. La reazione avviene in due fasi:

• Ab si lega agli Ag situati sulla membrana delle cellule
• Le cellule rivestite di Ab si legano l'una all'altra formando aggregati tridimensionali

Emoagglutinazione

Si allestisce una reazione di agglutinazione utilizzando anticorpi anti-A, anti-B e anti-AB.

Test di Coombs

Si possono cercare sia gli Ab fissati sui globuli rossi sia gli Ab presenti nel siero. Si usa il siero di Coombs costituito da gammaglobuline eterologhe ottenute immunizzando un coniglio o una capra con le immunoglobuline umane. Il test può essere:

• Diretto: per evidenziare Ab incompleti legati ai globuli rossi del soggetto. Metto a contatto gli eritrociti del paziente con il siero di Coombs al fine di stabilire se sono stati ricoperti in vivo da IgG; se le emazie agglutinano il test è positivo.
• Indiretto: per determinare gli autoanticorpi anti-IgG nel siero del paziente in esame. Incubo i globuli rossi del paziente con il siero del paziente e poi con il siero di Coombs. Se i globuli rossi agglutinano il test è positivo.

Immunofluorescenza

Sfrutta di coniugare agli Ab alcune sostanze fluorescenti (fluorocromi). La florescina (assorbe blu e emette giallo-verde) o la rodamina (assorbe giallo-verde e emette rosso) sono coniugate a Ab e mi permettono di evidenziare al microscopio a fluorescenza la presenza di Ag di superficie di cellule viventi in sospensione o di Ag presenti nel citoplasma o nei nuclei di sezioni di tessuto. Questo test può essere allestito in due modi:

• Metodo diretto: l'Ab specifico coniugato al fluorocromo si fa direttamente aderire agli Ag cellulari.
• Metodo indiretto: l'Ab specifico non coniugato si fa aderire agli Ag cellulari, successivamente si aggiunge un Ab anti-Ab primario coniugato con un fluorocromo.

L'immunofluorescenza è utilizzata per identificare i vari fenotipi delle cellule del sangue e delle loro sottopopolazioni, i componenti del complemento, gli Ag tissutali, tumorali, batterici, virali... Le sottopopolazioni linfocitarie marcate con Ab fluorescenti possono essere analizzate e separate mediante FACS che sfrutta un raggio laser e un rilevatore di luce per contare le cellule.

FACS

• Le sottopopolazioni linfocitarie marcate con Ab fluorescenti possono essere analizzate e separate mediante FACS che sfrutta un raggio laser e un rilevatore di luce per contare le cellule.
• Un campione contenente le cellule viene incubato con un Ab monoclonale marcato o con un fluorocromo.
• Le cellule che hanno legato ai loro Ag di membrana l'Ab fluorescinato vengono eccitate dal raggio laser e emettono luce.
• Il rilevatore misura la grandezza e il numero di cellule che hanno legato l'Ab marcato.
• Un computer analizza questi parametri e crea un diagramma su cui sono riportate il numero delle cellule e la loro tipologia.

Cromatografia per affinità

È una tecnica che separa le molecole in base a affinità per altre molecole. Per purificare l'Ag da miscele complesse, attaccando a biglie l'Ab che riconosce l'Ag. Uso delle colonne cromatografiche e dopo l'avvenuto legame faccio un lavaggio per rimuovere ciò che non è legato, abbasso il pH e in questo modo rompo il legame Ag-Ab.

Immunoprecipitazione

Aggiungo l'Ab a un estratto cellulare e un secondo Ab legato a una biglia magnetica. Uso il magnete per separare e rimuovere il materiale non legato.

Saggio radioimmunologico

È una tecnica molto sensibile che può rilevare la presenza di un Ag o di un Ab a concentrazioni molto basse. Il test si basa sulla competizione tra un Ag radiomarcato e uno non marcato per un Ab specifico. L'Ag è marcato con piccole quantità di isotopo radioattivo che emette raggi gamma. Misurando con un contatore gamma la quantità di Ag marcato in soluzione è possibile determinare la quantità di Ag non marcato.

RIA

Competizione tra Ag radiomarcato e non marcato per un Ab specifico. Ag marcato con piccole quantità di isotopo radioattivo che emette raggi γ, si allestisce serie di provette contenenti quantità costanti di Ag radiomarcato e Ab anti-Ag, si aggiunge quantità crescente del siero. Ab si può legare sia a Ag marcato che a quello non marcato. Misurare contatore γ quantità di Ag marcato rimasto in soluzione in questo modo determino concentrazione di Ag non marcato.

ELISA

Indiretto

Per rilevamento e determinazione della quantità di Ab. Micropozzetto ricoperto di Ag, aggiungo campione da analizzare (Ab primario) e lo si fa reagire con Ag. Aggiungo Ab secondario anti-Ab primario coniugato con enzima. Lavo via Ab secondario libero e aggiungo substrato enzima. Quantità di prodotto di reazione colorato valutato con lettori spettrofotometrici. Es. determinare quantità di Ab contro HIV.

Competitivo

Test di inibizione, concentrazione di Ab inversamente proporzionale a colore sviluppato. Incubare Ab primario con Ag da misurare. Aggiungo miscela Ag-Ab formatasi a micropozzetto con Ag: maggiore è la quantità di Ag nel campione, minore è la quantità di Ab primario libero. Aggiungo Ab secondario specifico per Ab primario, coniugato con enzima. Lavo Ab secondario e aggiungo substrato. Misuro prodotto di reazione colorato.

Sandwich

Micropozzetto ricoperto con Ab primario, aggiungo Ag da misurare e lascio incubare; aggiungo Ab secondario specifico per Ag. Lavo via Ab secondario libero e aggiungo substrato per enzima. Intensità del colore proporzionale a quantità di Ab secondario marcato.

Selezione NK

Si crea un cocktail con Ab legati in complessi tetramerici diretti contro cellule non NK e glicoferina-A sugli eritrociti. Si formano aggregati chiamati immunorosette che precipitano dopo centrifugazione.

Librerie fagiche

Si possono isolare fagi che esprimono un determinato Fv per infettare nuovi batteri. Recupero i geni che codificano il sito di legame per Ag, le sequenze complete vengono introdotte in una linea cellulare particolare e le cellule transfettate possono secernere Ab con caratteristiche simili a Ab monoclonali fatti con ibridomi di topo.

Immunocitochine

Sono coniugati testati in trapianti anti-tumorale in cui Fv contro il tumore è legato a una citochina di interesse.

Isolazione di linfociti, monociti, CD, NK

Uso un gradiente liquido Ficoll-Hypaque. Gli eritrociti e i granulociti sono più densi, passano attraverso il Ficoll e sedimentano, si ottiene un anello di cellule mononucleate (PBMC) da centrifugare e contare.

Studio linfociti T

Per monitorare la funzionalità della risposta dei linfociti T vengono utilizzati vari stimolatori tra cui:

• Attivatori monoclonali come i mitogeni (PHA, ConA, PWM).
• I superantigeni che attivano numerosi cloni di cellule T mediante interazioni con alcune porzioni Vbeta del TCR sui linfociti T e la parte non polimorfica delle molecole MHC di classe II sulle APC.
• Gli Ab anti-CD3, CD2, CD28 molecole che sono coinvolte nella trasduzione del segnale d'attivazione.
• Le cellule allogeniche, lo studio della risposta ad alloantigeni si effettua su colture miste linfocitarie in cui i linfociti T in esame sono stimolati a proliferare dalle molecole MHC espresse da leucociti allogenici.

ELISPOT

La produzione di citochine da parte dei linfociti T in risposta all'attivazione può essere rilevata utilizzando la tecnica di ELISPOT: gli Ab citochine-specifici sono legati alla superficie di una piastra petri. Le cellule T attivate sono aggiunte alla piastra. Le citochine secrete grazie all'azione delle cellule T attivate sono catturate dagli Ab. Le citochine catturate sono presentate a un secondo Ab citochine-specifici accoppiati a un enzima e dà vita a una macchia colorata di precipitato.

Apoptosi

È una forma di morte cellulare, geneticamente programmata, il cui fine è l'eliminazione di cellule non desiderate dell'organismo, attraverso l'attivazione di una sequenza di eventi coordinati e con dispendio di energia della cellula stessa. Si verifica: durante embriogenesi, come meccanismo omeostatico all'interno di un tessuto, come meccanismo di difesa nelle reazioni immunitarie, quando le cellule sono danneggiate, durante l'invecchiamento.

È un fenomeno geneticamente programmato che richiede energia; si svolge con una serie sequenziale di reazioni biochimiche e di modificazioni morfologiche. Può intervenire su cellule che hanno subito un danno di vario tipo, ma anche su cellule sane. È anche un processo fisiologico fondamentale per interrompere le risposte immunitarie, eliminare cellule immuni non più necessarie e per uccidere cellule con patogeni intracellulari o cellule tumorali. Regola la densità di una popolazione cellulare (correlazione crescita cellulare e apoptosi).

Caratteristiche morfologiche

• Diminuzione dimensioni cellulari
• Condensazione cromatina
• Formazione estroflessioni citoplasmatiche e corpi apoptotici
• Fagocitosi di cellule o corpi apoptotici da parte di fagociti

Fasi sequenziali

• Induzione: caspasi 8,10 (estrinseca) o 9 (intrinseca)
• Esecuzione: caspasi 3, 6, 7
• Degradazione: taglio proteine citoplasmatiche, nucleo e DNA

Caspasi sono proteasi che tagliano le proteine; 14 caspasi che costituiscono la cascata enzimatica. L'apoptosi è indotta da danni al DNA che attivano il gene Tp53 (gene oncosoppressore), il cui prodotto si accumula e arresta il ciclo cellulare. Se la riparazione avviene allora il ciclo riprende altrimenti viene attivata Bax e inizia l'apoptosi.

Apoptosi estrinseca

Fas

FasL trimerico si lega a Fas sulla superficie della cellula bersaglio e lo trimerizza (attivazione del segnale apoptotico). La trimerizzazione di Fas porta all'aggregazione dei suoi domini di morte intracitoplasmatici (DD, per l'interazione di altri segnali di morte). I DD reclutano FADD (si crea il complesso di segnalazione di morte); FADD possiede un dominio DED responsabile del reclutamento della pro-caspasi 8 (forma inattiva) che viene attivata tramite l'autoproteolisi e dà inizio alla cascata proteolitica.

TNF

TNF si lega al recettore TNFR e induce la trimerizzazione del recettore (fondamentale per l'attivazione delle vie di segnalazione). I domini di morte di TNFR reclutano TRADD che funge da piattaforma per il reclutamento di proteine adattatrici ulteriori. TRADD recluta FADD tramite l'interazione dei loro domini di morte; FADD recluta la pro-caspasi 8 (inattiva) che viene attivata tramite l'autoproteolisi e dà inizio alla cascata proteolitica.