Appunti Immunologia

-TITOLO ANTICORPALE DEL SIERO

Aggiungere a una serie di provette un egual volume di Ab a diluizione crescente e una quantità

costante di Ag corpuscolato. Dopo un periodo di incubazione avviene l'agglutinazione. L'ultima

diluizione in cui si osserva l'agglutinazione è definita titolo del siero. la reazione avviene in 2 fasi:

1. Ab si lega agli Ag situati sulla membrana delle cellule

2. le cellule rivestite di Ab si legano l'una all'altra formando aggregati tridimensionali

-EMOAGGLUTINAZIONE

Si allestisce una reazione di agglutinazione utilizzando anticorpi anti-A, anti-B e anti-AB

-TEST DI COOMBS

Si possono cercare sia gli Ab fissati sui globuli rossi sia gli Ab presenti nel siero. si usa il siero di

Coombs costituito da gammaglobuline eterologhe ottenute immunizzando un coniglio o una capra

con le immunoglobuline umane.

Il test può essere:

-diretto: per evidenziare Ab incompleti legati ai globuli rossi del soggetto. metto a contato gli

eritrociti del paziente con il siero di Coombs al fine di stabilire se sono stati ricoperti in vivo da IgG;

se le emazie agglutinano il test è positivo

-indiretto: per determinare gli autoanticorpi anti-IgG nel siero del paziente in esame. incubo i

globuli rossi del paziente con il siero del paziente e poi con il siero di Coombs. se i globuli rossi

agglutinano il test è positivo

-IMMUNOFLUORESCENZA

Sfrutta di coniugare agli Ab alcune sostanze fluorescenti (fluorocromi). La florescina (assorbe blu e

emette giallo-verde) o la rodamina (assorbe giallo-verde e emette rosso) sono coniugate a Ab e mi

permettono di evidenziare al microscopio a fluorescenza la presenza di Ag di superficie di cellule

viventi in sospensione o di Ag presenti nel citoplasma o nei nuclei di sezioni di tessuto. Questo test

può essere allestito in due modi:

-metodo diretto: l'Ab specifico coniugato al fluorocromo si fa direttamente aderire agli Ag cellulari

-metodo indiretto: l'Ab specifico non coniugato si fa aderire agli Ag cellulari, successivamente si

aggiunge un Ab anti-Ab primario coniugato con un fluorocromo.

L'immunofluorescenza è utilizzata per identificare i vari fenotipi delle cellule del sangue e delle loro

sottopopolazioni, i componenti del complemento, gli Ag tissutali, tumorali, batterici, virali...

Le sottopopolazioni linfocitarie marcate con Ab fluorescenti possono essere analizzate e separate

mediante mediante FACS che sfrutta un raggio laser e un rilevatore di luce per contare le cellule

-FACS

Le sottopopolazioni linfocitarie marcate con Ab fluorescenti possono essere analizzate e separate

mediante mediante FACS che sfrutta un raggio laser e un rilevatore di luce per contare le cellule

-un campione contenente le cellule vene incubato con un Ab monoclonale marcato o con un

fluorocromo

-le cellule che hanno legato ai loro Ag di membrana l'Ab fluorescinato vengono eccitate dal raggio

laser e emettono luce

-il rilevatore misura la grandezza e il numero di cellule che hanno legato l'Ab marcato-un computer

analizza questi parametri e crea un diagramma su cui sono riportate il numero delle cellule e la loro

tipologia

-CROMATOGRAFIA PER AFFINITA’

È una tecnica che separa le molecole in base a affinità per altre molecole. Per purificare l'Ag da

miscele complesse, attaccando a biglie l'Ab che riconosce l'Ag. Uso delle colonne cromatografiche e

dopo l'avvenuto legame faccio un lavaggio per rimuovere ciò che non è legato, abbasso il pH e in

questo modo rompo il legame Ag-Ab

-IMMUNOPRECIPITAZIONE

Aggiungo l'Ab a un estratto cellulare e un secondo Ab legato a una biglia magnetica. Uso il magnete

per separare e rimuovere il materiale non legato

-SAGGIO RADIOIMMUNOLOGICO

È una tecnica molto sensibile che può rilevare la presenza di un Ag o di un Ab a concentrazioni

molto basse. il test si basa sulla competizione tra un Ag radiomarcato e uno non marcato per un Ab

specifico. L'Ag è marcato con piccole quantità di isotopo radioattivo che emette raggi gamma.

Misurando con un contatore gamma la quantità di Ag marcato in soluzione è possibile determinare

la quantità di Ag non marcato

-RIA

Competizione tra Ag radiomarcato e non marcato per un Ab specifico. Ag marcato con piccole

quantità di isotopo radioattivo che emette raggi γ, si allestisce serie di provette contenenti quantità

costanti di Ag radiomarcato e Ab anti-Ag, si aggiunge quantità crescente del siero. Ab si può legare

sia a Ag marcato che a quello non marcato. Misurare contatore γ quantità di Ag marcato rimasto in

soluzione in questo modo determino concentrazione di Ag non marcato

-ELISA

INDIRETTO

Per rilevamento e determinazione della quantità di Ab. Micropozzetto ricoperto di Ag, aggiungo

campione da analizzare (Ab primario) e lo si fa reagire con Ag. Aggiungo Ab secondario anti-Ab

primario coniugato con enzima. Lavo via Ab secondario libero e aggiungo substrato enzima.

Quantità di prodotto di reazione colorato valutato con lettori spettrofotometrici

Es. determinare quantità di Ab contro HIV

COMPETITIVO

Test di inibizione, concentrazione di Ab inversamente proporzionale a colore sviluppato.

Incubare Ab primario con Ag da misurare. Aggiungo miscela Ag-Ab formatasi a micropozzetto con

Ag: maggiore è la quantità di Ag nel campione, minore è la quantità di Ab primario libero. Aggiungo

Ab secondario specifico per Ab primario, coniugato con enzima. Lavo Ab secondario e aggiungo

substrato. Misuro prodotto di reazione colorato

SANDWICH

Micropozzetto ricoperto con Ab primario, aggiungo Ag da misurare e lascio incubare; aggiungo Ab

secondario specifico per Ag. Lavo via Ab secondario libero e aggiungo substrato per enzima.

Intensità del colore proporzionale a quantità di Ab secondario arcato

-SELEZIONE NK

Si crea un cocktail con Ab legati in complessi tetramerici diretti contro cellule non NK e glicoferina-A

sugli eritrociti. Si formano aggregati chiamati immunorosette che precipitano dopo centrifugazione

-LIBRERIE FAGICHE

Si possono isolare fagi che esprimono un determinato Fv per infettare nuovi batteri. Recupero i geni

che codificano il sito di legame per Ag, le sequenze complete vengono introdotte in una linea

cellulare particolare e le cellule transfettate possono secernere Ab con caratteristiche simili a Ab

monoclonali fatti con ibridomi di topo

-IMMUNOCITOCHINE

Sono coniugati testati in trapianti anti-tumorale in cui Fv contro il tumore è legato a una citochina

di interesse

-ISOLAZIONE DI LINFOCITI, MONOCITI, CD, NK

Uso un gradiente liquido Ficoll-Hypaque. Gli eritrociti e i granulociti sono più densi, passano

attraverso il Ficoll e sedimentano, si ottiene un anello di cellule mononucleate (PBMC) da

centrifugare e contare

-STUDIO LINFOCITI T

Per monitorare la funzionalità della risposta dei linfociti T vengono utilizzati vari stimolatori tra cui:

-attivatori monoclonali come i mitogeni (PHA, ConA, PWM)

-i superantigeni che attivano numerosi cloni di cellule T mediante interazioni con alcune porzioni

Vbeta del TCR sui linfociti T e la parte non polimorfica delle molecole MHC di classe II sulle APC

-gli Ab anti-CD3, CD2, CD28 molecole che sono coinvolte nella trasduzione del segnale d'attivazione

-le cellule allogeniche, lo studio della risposta ad alloantigeni si effettua su colture miste linfocitarie

in cui i linfociti T in esame sono stimolati a proliferare dalle molecole MHC espresse da leucociti

allogenici

-ELISPOT

La produzione di citochine da parte dei linfociti T in risposta all'attivazione può essere rilevata

utilizzando la tecnica di ELISPOT:

gli Ab citochine-specifici sono legati alla superficie di una piastra petri. Le cellule T attivate sono

aggiunte alla piastra. Le citochine secrete grazie all'azione delle cellule T attivate sono catturate

dagli Ab. Le citochine catturate sono presentate a un secondo Ab citochine-specifici accoppiati a un

enzima e dà vita a una macchia colorata di precipitato

16. APOPTOSI

È una forma di morte cellulare, geneticamente programmata, il cui fine è l’eliminazione di cellule

non desiderate dell’organismo, attraverso l’attivazione di una sequenza di eventi coordinati e con

dispendio di energia della cellula stessa.

Si verifica: durante embriogenesi, come meccanismo omeostatico all’interno di un tessuto, come

meccanismo di difesa nelle reazioni immunitarie, quando le cellule sono danneggiate, durante

l’invecchiamento.

È un fenomeno geneticamente programmato che richiede energia; si svolge con una serie

sequenziale di reazioni biochimiche e di modificazioni morfologiche. Può intervenire su cellule che

hanno subito un danno di vario tipo, ma anche su cellule sane. È anche un processo fisiologico

fondamentale per interrompere le risposte immunitarie, eliminare cellule immuni non più

necessarie e per uccidere cellule con patogeni intracellulari o cellule tumorali. Regola la densità di

una popolazione cellulare (correlazione crescita cellulare e apoptosi)

Caratteristiche morfologiche:

-diminuzione dimensioni cellulari

-condensazione cromatina

-formazione estroflessioni citoplasmatiche e corpi apoptotici

-fagocitosi di cellule o corpi apoptotici da parte di fagociti

Fasi sequenziali:

-induzione: caspasi 8,10 (estrinseca) o 9 (intrinseca)

-esecuzione: caspasi 3, 6, 7

-degradazione: taglio proteine citoplasmatiche, nucleo e DNA

Caspasi sono proteasi che tagliano le proteine; 14 caspasi che costituiscono la cascata enzimatica

L’apoptosi è indotta da danni al DNA che attivano il gene Tp53 (gene oncosoppressore), il cui

prodotto si accumula e arresta il ciclo cellulare. Se la riparazione avviene allora il ciclo riprende

altrimenti viene attivata Bax e inizia l’apoptosi

APOPTOSI ESTRINSECA

-Fas

FasL trimerico si lega a Fas sulla superficie della cellula bersaglio e lo trimerizza (attivazione del

segnale apoptotico). La trimerizzazione di Fas porta all’aggregazione dei suoi domini di morte

intracitoplasmatici (DD, per l’interazione di altri segnali di morte). I DD reclutano FADD (si crea il

complesso di segnalazione di morte); FADD possiede un dominio DED responsabile del

reclutamento della pro-caspasi 8 (forma inattiva) che viene attivata tramite l’autoproteolisi e dà

inizio alla cascata proteolitica

-TNF

TNF si lega al recettore TNFR e induce la trimerizzazione del recettore (fondamentale per

l’attivazione delle vie di segnalazione). I domini di morte di TNFR reclutano TRADD che funge fa

piattaforma per il reclutamento di proteine adattatrici ulteriori. TRADD recluta FADD tramite

l’interazione dei loro domini di morte; FADD recluta la pro-caspasi 8 (inattiva) che viene attivata

tramite l’autoproteolisi e dà inizio alla cascata proteolitica

APOPTOSI