Appunti Organi artificiali

(QMR).

Questa apparecchiatura produce una particolare corrente elettrica con quanti di energia, che non aumenta la

temperatura del tessuto a più di 50 °C, normalmente per evitare il surriscaldamento, irrigo con acqua microfiltrata lo

scaffold.

Pertanto, l'energia sulla punta dell'ago rompe i legami molecolari della ECM senza ustioni o danni; il robot realizza un

sistema regolare di microcanali spessi all'interno dell'impalcatura, evitando cambiamenti nella sua struttura

macroscopica e consentendo una distribuzione spaziale uniforme delle cellule dopo la semina. L’esofago viene messo su

un mandrino e fatto ruotare mentre l’ago collegato ad un braccio robotizzato si muove indipendentemente.

L'obiettivo del lavoro è la dimostrazione del concetto di ingegneria tissutale per la sostituzione dell'esofago.

Abbiamo preparato uno scaffold tubolare esofageo di derivazione suina per sostituire un tratto corrispondente

dell'esofago toracico in un modello sperimentale su animali di grandi dimensioni.

Dopo l'impianto, gli animali sopravvissuti sono stati sottoposti a un periodo di follow-up di 6 mesi, hanno subito una

gastrostomia per i primi giorni post-operatori, insieme a uno stent endoluminale, sono stati liberi di alimentarsi

autonomamente per via orale appena possibile e sono stati sottoposti a regolari controlli endoscopici.

Dopo il sacrificio abbiamo avuto la dimostrazione della rigenerazione a tutto spessore della parete esofagea nel tratto in

cui è stata sostituita dallo scaffold.

La lunghezza del tratto rigenerato corrispondeva all'impalcatura impiantata, il lume esofageo era libero e gli animali erano

in grado di andare avanti ad alimentazione orale autonoma.

L'approccio proposto è un ulteriore passo avanti sulla strada per superare con le tecniche di ingegneria tissutale i

problemi attuali legati alla trasposizione toracica.

Materiali e metodi

Si è partiti da campioni di esofago da 10 animali vivi di 40kg, maiali. Espiantare l’esofago a cuore battente ha evitato effetti

post-mortem.

Trasportato in ghiaccio è stato fatto riscaldare a temperatura ambiente, sciacquato in acqua ultra pura ed esposti ad una

soluzione di antibiotici. Successivamente si è seguito un protocollo di decellularizzazione. A seguito lavati per rimuovere i

residui di reagenti.

Gli scaffold sono stati decellularizzati in modo dinamico tramite un bioreattore dedicato che ha permesso ai detergenti di

circolare in condizioni sterili e dinamiche.

QMR trattamento perforativo

Lo scaffold decellularizzato è stato sottoposto a un microscopico trattamento perforativo attraverso un ago di 150 μm di

diametro montato su un braccio robotico a 3 assi e collegato al dispositivo QMR sviluppato per questa applicazione.

Campioni di esofago tubolare a spessore originale derivati dall'intero esofago completo sono stati montati su un supporto

cilindrico a base di agarosio che ha conservato la forma nativa, conduttivo per la corrente elettrica e rotante sul suo asse

longitudinale.

Questo sistema era dotato di un vassoio per i liquidi necessari all'irrigazione durante la procedura. Abbiamo utilizzato tre

diversi supporti di dimensioni crescenti per contenere esofagi di diverso diametro.

Ad ulteriore garanzia di non surriscaldare il tessuto, si eseguono i fori con un pattern non in sequenza.

La perforazione è stata eseguita dal robot seguendo un algoritmo specifico che guidava l'ago in direzione longitudinale, dal

polo superiore a quello inferiore, e dalla superficie muscolare esterna allo strato mucoso interno, fino a completare

l'intera circonferenza.

L'azione dell'ago è stata sufficiente a perforare il tessuto connettivo per tutto il suo spessore e gli spazi liberi tra i canali

sono stati considerati simili al loro diametro.

La soluzione MilliQ è stata utilizzata per mantenere umido il tessuto connettivo, in una cabina di sicurezza biologica di

classe II in condizioni asettiche.

Non è stato applicato alcun metodo di sterilizzazione finale, poiché tutte le fasi della procedura sono state eseguite in

completa sterilità.

Estrazione DNA e quantificazione

È stato quantificato con il kit commerciale.

Analisi istologiche e immunoistochimiche su scaffold esofageo nativo e decellularizzato

Campioni di esofagi nativi e di scaffold decellularizzati sono stati fissati in formalina e incorporati in paraffina.

Le sezioni esofagee trasversali da 2,5 µm sono state analizzate con ematossilina ed eosina (H&E) e tricromia di Masson al

microscopio ottico BX53 (Olympus).

Le sezioni sono state deparaffinate, sottoposte a recupero dell'antigene e bloccate in sieroalbumina bovina al 5%.

Le sezioni di tessuto sono state poi incubate con muscolo liscio, actina, citocheratina , collagene I (Sigma Aldrich),

collagene IV Biorbyt ), laminina (Sigma Aldrich), fibronectina (Abcam) ed elastina (Sigma Aldrich).

Le sezioni sono state lavate e incubate con il fluoroforo coniugato con anticorpi secondari (Thermo Fisher) per 1 ora a

temperatura ambiente.

Dopo la colorazione dei nuclei con Hoechst, le sezioni di tessuto sono state montate con Mowiol®4 88. Le immagini sono

state acquisite con il microscopio Axiovert 40 CFL (Zeiss) e il software LasX.

Gli altri campioni sono stati fissati con PFA 4% per 30 minuti, disidratati in saccarosio 30% per una notte e tagliati con

microcristalli criostatici, quindi sono state ottenute sezioni di 20 μm e colorate con Hoechst in blu per i nuclei e in verde

falloidina (f-actina) per i segni citoscheletrici.

Test biomeccanici

Per i test biomeccanici sono stati considerati i seguenti campioni: esofago porcino nativo (NPE), esofago porcino

decellularizzato (DPE) e esofago decellularizzato perforato (QMR).

Tutti i tessuti sono stati asportati lungo la direzione longitudinale, parallelamente all'asse principale del condotto e sono

state prelevate coppie di strisce adiacenti in direzione longitudinale e circonferenziale.

Le dimensioni delle strisce erano 25 mm di lunghezza e 5 mm di spessore.

I campioni vengono montati sulla macchina di misura e precaricati a 0,1 N, per metterli in leggera tensione, per eliminare i

valori errati iniziali dovuti al montaggio incorretto del campione.

Sono stati calcolati due moduli elastici in due regioni deformative differenti, una tra 0-10% e l’altra tra 60-100%.

Dalla curva ricavata leggo il comportamento composto dello scaffold, la deformazione plastica residua, la UTS al 200% di

deformazione.

Cultura cellulare

La fonte delle cellule era la tibia degli animali stessi, dopo essere state trattate e fatte proliferare. Dall’estrazione cellulare

all’utilizzo sono passati 21 giorni.

Utilizzo un bioreattore per la semina cellulare. Simile a quello per i vasi sanguigni. Quindi fluido di coltura dinamico,

immissione di nuovi nutrienti ed espulsione di rifiuti.

Risultati

La QMR consente di aumentare la superficie del tessuto decellularizzato, permettendo una maggiore affluenza di cellule

durante la semina.

Gli scaffold sono stati considerati decellularizzati in modo efficiente quando il contenuto di DNA era <50 ng/mg di ECM

secca, come suggerito in letteratura.

In tutti gli scaffold decellularizzati e perforati, il contenuto di DNA era ben al di sotto della soglia e significativamente

inferiore rispetto agli scaffold freschi, dimostrando un'efficiente decellularizzazione in tutti i campioni.

Confronto tra matrice extracellulare nativa, decellularizzata e QMR trattata, mediante analisi di

immunofluorescenza

La presenza di nuclei è stata analizzata mediante colorazione Hoechst e la presenza di cinque proteine essenziali della

ECM: laminina, fibronectina, elastina, collagene I e IV.

Come risultato si è notato che i nuclei sono stati rimossi efficacemente, mentre le componenti della matrice sono stati

conservati.

L'analisi di immunofluorescenza ha dimostrato che la composizione dell'ECM non è stata alterata a causa delle diverse

fasi di preparazione dello scaffold, dal momento che le proteine fondamentali sono ancora correttamente presenti.

Risultati biomeccanici

Curve stress-deformazione per pezzi di tessuto circonferenziale e longitudinale, per caratterizzare l’anisotropia.

Il trattamento di decellularizzazione e QMR irrigidisce l’esofago, il nativo se viene deformato al 100% poi torna indietro

elasticamente. I campioni irrigiditi sono meno complianti, trattengono le deformazioni.

Più rigido modulo elastico maggiore resiste meglio alle sollecitazioni resiste meno alle deformazioni

→ → →

Stima dell'aumento dell'area disponibile per la semina delle cellule

La microperforazione QMR ha permesso di creare microcanali all'interno degli scaffold esofagei. Di conseguenza, rispetto

a uno scaffold non perforato, la superficie disponibile per la semina delle MSC è aumentata grazie ai nuovi spazi creati

all'interno del tessuto connettivo.

Ciò è direttamente correlato al numero, al diametro e alla profondità dei canali.

In realtà, gli aghi utilizzati hanno una forma conica solo sulla punta e cilindrica sul resto.

Quindi, una possibile stima dei risultati della perforazione è stata ipotizzata come principalmente cilindrica e conica sulla

punta.

Semina di BM-MSCS in condizioni dinamiche

Gli scaffold tubolari sono stati coltivati per 30 giorni in condizioni dinamiche a causa dell'elevata complessità 3D data

dalla loro architettura e dalla presenza di tutti gli strati della parete esofagea.

Sono stati sottoposti a 3 procedure di risemina per massimizzare il contatto tra le cellule e gli scaffold e sono stati

analizzati al microscopio alla fine del periodo di incubazione per valutarne la vitalità.

Abbiamo avuto una dimostrazione del buon comportamento delle cellule, che hanno aderito con successo alla superficie

degli scaffold tubolari e sono penetrate facilmente nei microcanali, come mostrato dalle immagini SEM in cui le cellule

aderenti sono visibili nelle loro parti interne.

Inoltre, al termine della semina, è stata osservata la migrazione delle MSC al di fuori dei canali e tra le fibre ECM.

Riteniamo che ciò sia dovuto al tempo di coltura prolungato e alle risemine che hanno massimizzato il potenziale delle

cellule di diffondersi nel tessuto connettivo sfruttando le perdite aperte sulle pareti del microcanale.

Follow up post chirurgia

Nel primo gruppo di 5 porcellini, sono stati riscontrati molti problemi legati alla gastrostomia e al fissaggio dello stent e

purtroppo 4 animali hanno sofferto di gravi complicazioni addominali e al collo che li hanno portati alla morte.

In questi casi non è stato possibile eseguire le autopsie.

Nel secondo gruppo di 5 animali abbiamo cambiato la tecnica di gastrostomia e stent esofageo e solo uno degli animali

non è sopravvissuto a causa degli stessi problemi.

In questo caso l'autopsia ha confermato che l'impalcatura era ancora anastomizzata. Un totale di 5 animali (1 nel primo

gruppo, 4 nel secondo gruppo) ha