Appunti Ingegneria tissutale

1.INTRODUZIONE INGEGNERIA TISSUTALE

DEFINIZIONE

INGEGNERIA TISSUTALE= settore interdisciplinare che applica i principi dell’ingegneria e delle scienze della

vita per sviluppare sostituti biologici che hanno lo scopo di ripristinare, mantenere o migliorare una funzione di

un tessuto o di un intero organo.

OBIETTIVI

1) Superare le limitazioni di un approccio tradizionale del trapianto d’organo, che principalmente

riguardano la bassa disponibilità di organi e la possibilità di rigetto

2) Aumentare le capacità rigenerative dove sono già esistenti, in quanto il nostro corpo ha alcuni

meccanismi di riparazione intrinseci che dipendono dal tipo di tessuto.

3) Superare la mancanza delle capacità rigenerative dove non esistono

EVOLUZIONE: l’ingegneria tissutale si è sviluppata insieme ai biomateriali a partire dagli anni ’60. La prima

pelle artificiale risale alla fine degli anni ’90 e negli 2000 si hanno le prime protesi di sostituti ossei progettati a

partire da matrici contenenti cellule del tessuto osseo stesso.

PRODOTTI SVILUPPATI:

Prodotti di SUCCESSO:

➢ • Pelle Ingegnerizzata: viene utilizzata una matrice di collagene, costituita da una struttura

multistrato

• Cartilagine ingegnerizzata: viene impiegata nelle infiltrazioni di ginocchio con idrogel caricati con

cllule del tessuto connettivo che aiutano a ripristinare il tessuto cartilagineo

• Tessuto osseo ingegnerizzato: vengono impiantati degli scaffold, ovvero strutture in polimero

biodegradabile (PCL) che vengono colonizzati da osteociti che proliferano sopra.

Non vengono utilizzati per ossa scheletriche che supportano grandi carichi.

Prodotti MENO SVILUPPATI:

➢ • Vasi sanguigni ingegnerizzati: si deve trovare un compromesso per lo spessore del vaso, in modo

tale che questo sia abbastanza spesso da supportare la pressione sanguigna e allo stesso tempo

abbastanza sottile per far penetrare i nutrienti.

• Nervi ingegnerizzati: per esempio per reinstaurare la comunicazione nervo-muscolo

Sviluppi RECENTI:

➢ • Tessuto mammario ingegnerizzato: per superare le limitazioni delle protesi mammarie in silicone

(infiammazione da corpo esterno), si cerca di realizzare scaffold porosi in materiale plastico (PCL),

che si degradano nel tempo e permettono di coltivare tessuto adiposo.

ELEMENTI CHIAVE DELL’INGEGNERIA TISSUTALE

1) CELLULE

• Cellule staminali: o prelevate direttamente dal paziente o cellule staminali indotte (riportate allo

stadio staminale con una riprogrammazione di cellule adulte)

• Cellule primarie

In alcuni casi non risulta necessario ricorrere proprio alle cellule staminali ma è possibile utilizzare

cellule già differenziate.

2) SCAFFOLD: possono essere fatti di:

• Polimeri Naturali: collagene, chitosano, acido ialuronico, alginato, fibrina

• Polimeri sintetici: PLA, PGA, PCL

• Ceramiche: idrossiapatite

• Tessuti de-cellularizzati: si rompono i legami cellulari e rimane la matrice extra-cellulare (scaffold

naturale)

3) BIOMOLECOLE: hanno la funzione di facilitare i processi cellulari importanti per la crescita di tessuti in

vitro, come la migrazione delle cellule, la loro proliferazione e il differenziamento.

• Fattori di crescita: stimolano la crescita e l’organizzazione del tessuto e sono specifici per ogni

tessuto. Per esempio il VEGF è un fattore di crescita per le cellule endoteliali (cellule parete interna

vaso sanguigno)

• Citochine: sono molecole di segnalazione e comunicazione prodotte da una molteplicità di cellule

che regolano la risposta immunitaria e i processi di infiammazione con azione ravvicinata

• Ormoni: sono molecole di segnalazione e comunicazione prodotte da ghiandole e viaggiano nel

sangue, quindi hanno un’azione a distanza nella promozione dello sviluppo dei tessuti

Sia le citochine sia gli ormoni forniscono informazioni di comunicazione tra molecole, ma si differenziano su

vari aspetti: ORMONI CITOCHINE

Prodotti da ghiandole endocrine (es. Prodotte da varie cellule, principalmente da

SORGENTE tiroide) cellule immunitarie come macrofagi e

cellule endoteliali.

Viaggiano attraverso il flusso Possono agire localmente oppure

TRASPORTO sanguigno verso organi bersaglio sistematicamente nelle risposte

distanti. immunitarie.

Regolano processi fisiologici come Svolgono un ruolo chiave nelle risposte

FUNZIONE metabolismo, crescita e sviluppo. immunitarie, nell’infiammazione e nella

comunicazione cellulare.

Generalmente agiscono su tessuti e Agiscono su cellule vicine e modulano le

SPECIFICITA’ del target organi distanti risposte immunitarie

ESEMPI Insulina, cortisolo Interferoni, TNF

Ormoni: regolano generalmente processi fisiologici + ampi in tutto l’organismo.

Citochine: sono maggiormente coinvolte nelle risposte immunitarie localizzate e nella comunicazione

cellulare.

STRATEGIE DELL’INGEGNERIA TISSUTALE

Esistono 3 tipologie di strategie:

1) STRATEGIE BASATE SU APPROCCI CELLULARI: prevede una prima fase di coltura cellulare e poi una

fase di fabbricazione vera e propria. Si possono realizzare colture 2D ma anche strutture + complesse

(sferoidi, sospensioni cellulari, printing).

2) STRATEGIE BASATE SU SCAFFOLD: scaffold di diversi tipi (scaffold in stampa 3d, naturali, porosi)

3) STRATEGIE BASATE SU GENE-ACTIVATED

SCAFFOLD: sono scaffold in cui si

inseriscono molecole geneticamente

modificate, che trasportano pezzi di

informazione genetica (DNA o RNA).

Forniscono stimolo genetico con

sequenze nucleotidiche che vengono

rilasciate nel tessuto in crescita.

INGEGNERIA TISSUTALE VS MEDICINA RIGENERATIVA

INGEGNERIA TISSUTALE MEDICINA RIGENERATIVA

OBIETTIVO Sostituire o riparare tessuti o organi Ambito + ampio, che comprende non solo

danneggiati l’ingegneria dei tessuti ma anche meccanismi

naturali di riparazione del corpo.

STRATEGIA Rigenerazione principalmente in vitro Rigenerazione direttamente in vivo

APPROCCIO FASE 1: produzione di tessuti 1)Terapie basate su impianti: impianto nel

completamente formati in vitro, corpo di una matrice biomateriale (scaffold)

seminando cellule in una matrice con o senza cellule, per facilitare la

biomateriale (scaffold) con biomolecole rigenerazione del tessuto in vivo.

(fattori di crescita). 2) Terapie con cellule staminali

FASE 2: impianto del tessuto rigenerato 3) terapie geniche

nel corpo

APPLICAZIONI Tendono a concentrarsi sulla -Terapie sistemiche, come l’inversione di

rigenerazione di tessuti specifici (es. malattie degenerative

pelle, cartilagine ecc..) - Rigenerazione di organi danneggiati

Ad oggi la separazione tra

l’ingegneria tissutale e la medicina

rigenerativa non è così netta.

CELLULE E SCAFFOLD

FONTI CELLULARI

• Cellule PRIMARIE: derivano direttamente dal tessuto di interesse

• Cellule STAMINALI: cellule pluripotenti con la capacità di differenziarsi

Queste tipologie di cellule possono essere usate con:

- Tecniche di coltura: che possono essere monostrati 2D o sistemi di coltura 3D

- Bioreattori: sistemi che permettono di migliorare la crescita delle cellule e lo sviluppo di tessutiù

ECM: La sua funzione è quella di fornire supporto strutturale e influenzare il comportamento delle cellule.

L’ECM è costituita principalmente da proteine, polisaccaridi e glicoproteine.

SCAFFOLD

Lo Scaffold è una struttura che ha lo scopo di mimare la matrice extra-cellulare naturale (ECM) per supportare

la regolare crescita delle cellule.

Lo scaffold ha diverse funzioni, tra cui:

Capacità di influenzare il comportamento delle cellule tramite una serie di stimoli principalmente

➢ biochimici e fisici

Funge da filtro e veicolo per materiali nutrienti e per l’ossigeno

➢ La sua topografia permette di migliorare l’adesione cellulare e la trasduzione meccano-elettrica degli

➢ stimoli

REQUISITI:

• Biocompatibilità

• Biodegradabilità

• porosità

aspetti da considerare per la realizzazione di uno

scaffold:

Aspetti geometrici (forma e dimensioni)

▪ Aspetti meccanici (stiffness): ad esempio il

▪ tessuto cardiaco ha un modulo elastico di una

decina di kPa, quindi si dovrà cercare un

materiale che abbia lo stesso modulo elastico e quindi una stiffness adeguata

Micro-ambiente biochimico (fattori di crescita)

▪ Scaffold ECM : formazione della matrice (legame tra cellule)

▪ Rilascio controllato di molecole eventualmente inserite all’interno per scopi specifici (per es. pezzi di

▪ codice genetico)

Micro-ambiente biofisico: si fornisce i giusti stimoli fisici per il corretto sviluppo delle cellule, prestando

▪ attenzione in particolare anche alla topografia (superficie) dello scaffold.

Per esempio per un tessuto cardiaco creerò uno scaffold che si deforma in maniera periodica con una

frequenza di circa 1-2Hz.

ESEMPI DI MATERIALI:

• Polimeri naturali: collagene, chitosano, acido ialuronico e alginato

• Polimeri sintetici: PLA, PGA, PCL

• Ceramiche: idrossiapatite

• Compositi: combinazione di materiali naturali e sintetici

TECNICHE DI FABBRICAZIONE:

• Elettrospinning

• 3D printing

• Freeze-drying

• Ecc…

SFIDE

1) VASCOLARIZZAZIONE

Sfida: risulta estremamente difficile creare una rete funzionale di vasi sanguigni, necessaria per lo sviluppo

cellulare e per il loro nutrimento.

Perché è importante: senza una rete vascolare, i tessuti di pochi mm spesso muoiono perché le cellule centrali

vengono private di ossigeno e nutrienti.

Invece se lo strato cellulare è abbastanza sottile, l’ossigeno e i tessuti riescono a penetrare per gradiente di

concentrazione (diffusione), seguendo la legge di Fick.

Soluzioni attuali: si deve promuovere l’angiogenesi (formazione di nuovi vasi) combinando l’uso di:

- VEGF (fattore di crescita dell’endotelio) per promuovere la formazione di vasi sanguigni

- 3D printing

- Co-colture con cellule endoteliali (cellule della linea dei vasi sanguigni)

Nonostante tutto, raggiungere una vascolarizzazione completamente funzionale rimane difficile.

2) IMMUNOGENICITA’ E RIGETTO IMMUNITARIO

Sfida: i tessuti ingegnerizzati possono scatenare una risposta immunitaria se i materiali o le cellule vengono

riconosciuti come estranei dall’organismo

Perché è importante: una risposta immunitaria può portare al rigetto del tessuto impiantato, riducendone

l’efficacia e la funzionalità a lungo termine.

Soluzioni attuali:

- Cellule autologhe (derivate dal corpo del paziente)

- Scaffolf decellularizzati

- Materiali immuno-modulanti per ridurre il rigetto immunitario

3) SORGENTE DELLE CELLULE

Sfida: ottenere una fonte affidabile ed etica di cellule per l’ingegneria dei tessuti è difficile, in quanto le cellule

staminali embrionali sollevano preoccupazioni etiche, mentre le cellule staminali adulte possono essere

difficili da prelevare in grandi quantità.

Perché è importante: il successo dell’ingegneria dei tessuti dipende fortemente dalla disponibilità di cellule

appropriate per i diversi tessuti.

Soluzioni attuali: utilizzo di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), che vengono riprogrammate a partire

da cellule adulte per comportarsi come cellule staminali embrionali. Tuttavia, ottenere cellule differenziate di

alta qualità a partire dalle iPSC rimane ancora una sfida (cellule differenziate immature).

4) DESIGN E BIOCOMPATIBILITA’ DELLO SCAFFOLD

Sfida: progettare scaffold che imitino l’ECM e forniscano l’ambiente corretto affinché le cellule crescano, si

differenzino e funzionino adeguatamente è un compito complesso. I materiali utilizzati devono essere

biocompatibili, biodegradabili e in grado di guidare la formazione del tessuto.

Perché è importante: lo scaffold è la struttura di base su cui crescono le cellule e se è troppo rigido o troppo

morbido o se si degrada troppo rapidamente, il tessuto potrebbe non svilupparsi correttamente.

Soluzioni attuali: combinazioni di:

- Biomateriali come collagene, alginato e polimeri sintetici

- Tecniche di stampa 3D e biofabbricazione per creare scaffold complessi e specifici per il paziente.

5) INTEGRAZIONE FUNZIONALE CON IL TESSUTO OSPITE

Sfida: anche se un tessuto può essere ingegnerizzato in laboratorio, è difficile garantire che, una volta

impiantato, si integri perfettamente con i tessuti del paziente.

Perché è importante: se il tessuto ingegnerizzato non si integra correttamente, potrebbe non funzionare come

previsto o danneggiare il paziente.

Soluzioni attuali: miglioramento della compatibilità meccanica e biologica dei tessuti per garantire una

comunicazione efficace con i tessuti ospiti circostanti.

6) SCALABILITA’ E PRODUZIONE

Sfida: produrre tessuti in grande quantità mantenendo qualità e funzionalità rappresenta una sfida

significativa.

Perché è importante: affinché l’ingegneria tissutale sia commercialmente sostenibile e ampiamente

applicabile in contesti clinici, sono essenziali processi di produzione scalabili (produzione in grande quantità,

senza un aumento significativo dei costi)

Soluzioni attuali: sviluppo di metodi automatizzati e standardizzati per aumentare la produzione di tessuti.

7) VITALITA’ E FUNZIONALITA’ A LUNGO TERMINE

Sfida: garantire che i tessuti ingegnerizzati funzionino correttamente nel tempo è ancora un problema. I tessuti

devono sopravvivere e mantenere la loro funzionalità all’interno del corpo per anni.

Perché è importante: il successo a breve termine in laboratorio non garantisce la sopravvivenza o l’integrazioen

a lungo termine.

Soluzioni attuali: non esiste un approccio standard e sono necessari studi a lungo termine per validare

qualsiasi nuova strategia.

8) SFIDE ETICHE

Sfida: l’ingegneria tissutale solleva questioni etiche, in particolare quando si utilizzano cellule staminali umane

e modificazioni genetiche.

Soluzioni attuali: gli enti regolatori stanno sviluppando linee guida per una ricerca responsabile su cellule e

tessuti ingegnerizzati.

9) SFIDE DI STANDARDIZZAZIONE

Sfida: necessità di protocolli standardizzati per produzione, test e controllo qualità.

Perché è importante: per garantire sicurezza ed efficacia

Soluzioni attuali: sono in corso tentativi di standardizzazione, ma il campo è ancora troppo immaturo.

Lo svantaggio è che non abbiamo linee guida da seguire, ma questo può essere anche un vantaggio, perché

lascia più spazio alla creatività.

10) SFIDE NORMATIVE

Sfida: il percorso normativo per l’approvazione dei tessuti ingegnerizzati è complicato e varia da paese a paese.

Perché è importante: l’approvazione è essenziale per l’uso clinico dei tessuti ingegnerizzati.

Soluzioni attuali: gli enti regolatori stanno sviluppando linee guida per l’uso responsabile dei tessuti

ingegnerizzati, ma il campo si evolve rapidamente, quindi è difficile mantenere le normative aggiornate.

DIREZIONI FUTURE

1) 3D BIOPRINTING E BIOFABBRICAZIONE

Prospettive future:

Posizionamento preciso di cellule, fattori di crescita e biomateriali strato per strato per creare strutture

o tissutali complesse

Creazione di tessuti e organi specifici per il paziente

o

Applicazioni:

- Impianti e protesi personalizzate

- Stampa di tessuti vascolarizzati

- Potenziale stampa di organi interi a lungo termine

2) VASCOLARIZZAZIONE E INTEGRAZIONE TISSUTALE

Prospettive future: risolvere la sfida della vascolarizzazione per crescere tessuti + grandi e complessi tramite:

Cellule endoteliali e fattori di crescita

o Vasi sanguigni biostampati

o Sviluppo di biomateriali che favoriscano una rapida crescita di vasi dopo l’impianto

o

Applicazioni:

- Costruzione di tessuti spessi e funzionali con sufficiente apporto di sangue

- Accelerazione dell’integrazione dei tessuti nei trapianti ingegnerizzati

- Miglioramento della sopravvivenza e funzionalità dei tessuti impiantati

3) ORGANS-ON-CHIP E MODELLI MICRO-FLUIDICI

Prospettive future: simulare le funzioni degli organi su un chip, dove i tessuti ingegnerizzati possono imitare

l’ambiente dinamico del corpo umano, compreso flusso sanguigno, apporto di nutrienti e rimozione di rifiuti.

Applicazioni:

- Test di farmaci e medicina personalizzata

- Modellazione di malattie (es. cancro o diabete)

- Riduzione dell’uso di animali nei test farmacologici e

tossicologici

4) TENCOLOGIE DI EDITING GENETICO

Prospettive future: modificare geneticamente le cellule (tramite tecnologie di editing genetico come CRISPR)

per: Migliorare la funzionalità cellulare

o Ridurre l’immunogenicità

o Correggere difetti genetici prima dell’impianto

o

Applicazioni:

- Ingegnerizzare tessuti con proprietà rigenerative potenziate

- Creare tessuti compatibili con il sistema immunitario del paziente per minimizzare il rischio di rigetto

- Correggere disturbi genetici in tessuti o organi ingegnerizzati

5) CELLULE STAMINALI PLURIPOTENTI INDOTTE (iPSC)

Prospettive future:

Uso di iPSC specifiche del paziente, derivate da cellule adulte e riprogrammate per comportarsi come

o cellule staminali embrionali

Superare le problematiche etiche legate all’uso di cellule staminali embrionali

o

Applicazioni:

- Innesti tissutali personalizzati usando iPSC specifiche del paziente per ridurre il rischio di rigetto

- Studio dei meccanismi delle malattie e sviluppo di terapie per patologie degenerative

- Uso di iPSC in organoidi e tessuti ingegnerizzati per ricerca e terapie rigenerative

6) SCAFFOLD INTELLIGENTI

Prospettive future: scaffold intelligenti che rispondono a cambiamenti ambientali (es. pH, temperatura, forze

meccaniche) per:

Rilasciare molecole bioattive che promuovono la guarigione o prevengono infezioni

o Modificare le proprietà superficiali in modo controllato

o

Esempi:

Scaffold c