Appunti Genetica molecolare umana

IBRIDAZIONE COMPETITIVA (CISS),

Solitamente per la FISH viene usato un approccio definito “competitive in situ suppression” perché vengono

usate sonde di DNA genomico che contengono delle sequenze ripetute intersperse come Alu e L1 usando sonde

à

così grandi che vanno da 40 a 400 o più Kb, queste sonde contengono anche sequenze ripetute marcate insieme alle

sequenze singole.

Insieme alla sonda marcata, viene aggiunto nel mix di ibridazione un eccesso di DNA genomico oppure meglio un DNA

Cot1.

arricchito in sequenze ripetute, chiamato Sonda+Cot1 vengono denaturati e lasciati a 37°C in una fase di PRE-

ANNEALING e poi la sonda viene messa sul vetrino. In questo modo l’eccesso di DNA ripetuto,

ossia il Cot non marcato, satura tutte le

regioni presenti sulla sonda marcata che

riconoscono sequenze ripetute vengono

à

neutralizzati tutti i frammenti della sonda

marcata, che riconoscono sequenze

ripetute e che quindi non ibriderebbero in

maniera specifica una particolare regione,

ma potrebbero attaccarsi su tutti i

cromosomi dell’intero genoma.

In realtà, oggi non viene effettuato il pre-annealing: alla sonda marcata viene aggiunto Cot1 e poi denaturati e messi

sul vetrino.

Cot1 rappresenta la prima frazione di DNA che si riannila dopo la denaturazione.

Noi utilizziamo una sonda molto grande che viene marcata: questa conterrà per forza anche sequenze ripetute, che si

attaccano potenzialmente a tutte le regioni genomiche ripetute del DNA target. Per eliminare questo problema,

denaturiamo la sonda insieme al DNA Cot1, che è un DNA altamente ripetuto. Il Cot1 non è marcato e si lega alla

sonda marcata che riconosce le sequenze ripetute → in questo modo le sequenze ripetute della sonda non si

appaiono al DNA target. A volte si riesce ad usare il cDNA (che non ha sequenze ripetute) ma c’è un alto limite di

risoluzione. Per questo vengono sempre usate sequenze genomiche, anche piccole, con sequenze ripetute. 54

POST-IBRIDAZIONE

LAVAGGI:

1) effettuati con condizioni appropriate di forza ionica e temperatura che dipenderanno dall’entità di

omologia della sonda con la sequenza bersaglio:

l’alta temperatura diminuisce la stabilità dell’ibrido (sonda-regione target) e favorisce la denaturazione

la forza ionica aumenta la stabilità dell’ibrido e favorisce la rinaturazione.

Si utilizzano lavaggi a:

• stringenza alta per sonde con omologia alta temperatura alta e forza ionica bassa

à

• stringenza bassa con omologia bassa temperatura bassa e forza ionica alta

à

Se voglio ibridare DNA di specie diverse bisogna usare lavaggi meno stringenti.

BLOCCAGGIO

2) trattamento con BSA (siero albumina di bovino), satura i siti a cui si potrebbero legare in

maniera aspecifica l’anticorpo/avidina coniugati al fluorocromo

DETECTION:

3) se la sonda non è marcata direttamente con fluorocromo, ma è marcata con una molecola

reporter, bisogna visualizzare la sonda

ibridata trattando l’ibrido con

molecole fluorescenti in grado di

riconoscere in modo specifico le sonde

marcate. L’ibrido viene messo a

contatto con un anticorpo che

riconosce la molecola reporter. Nel

caso della biotina si utilizza l’avidina

legata al fluorocromo.

MARCATURA

La tecnica è molto duttile: permette di usare più sonde contemporaneamente. Questo perché ci sono molti

fluorocromi che possono marcare sonde diverse. Di solito si usa il DAPI per vedere i cromosomi. Una sonda può anche

essere marcata in combinazione con due diversi fluorocromi.

La marcatura avviene:

mediante l’incorporazione di un precursore nucleotidico (dUTP) legato direttamente a coloranti fluorescenti

o METODO DIRETTO

(viene saltato lo step della detection) à

mediante l’incorporazione di dUTP legato ad una molecola indicatrice (reporter) come la biotina (BIO) e la

o METODO INDIRETTO

digoxigenina (DIG) che vengono rilevate mediante anticorpi fluorescenti à

NICK TRANSLATION

Per la FISH solitamente si usa marcare mediante “nick-translation”, metodica enzimatica che si basa sull’attività della

Dnasi1 pancreatica e della DNA polimerasi I di E. Coli e ricalca quasi per intero la reazione di riparo dei danni causati

sul DNA batterico dai raggi UV: 55

Dnasi I

- La (endonucleasi) produce su entrambi i filamenti dei tagli (“nick”) tra le due basi adiacenti

DNA Pol I

- La ha un’attività esonucleolitica 5’-3’ e attività polimerasica 5’-3’.

Questa tecnica solitamente si utilizza quando è necessario marcare sonde di una certa dimensione. L’endonucleasi fa

tagli sul doppio filamento di DNA: a livello di questi gap la DNA polimerasi, poiché è in presenza sia di nucleotidi

marcati che non marcati, mediante l’attività esonucleotidica da una parte e polimerasica dall’altra fa sì che ci sia

l’inserimento di nucleotidi marcati all’interno di questi frammenti di DNA a doppio filamento.

Per effettuare questa marcatura esistono dei

kit per cui è possibile comprare soltanto gli

enzimi necessari e mettere a punto questa

metodica: per controllare la qualità della

marcatura basta soltanto valutare la grandezza

dei frammenti che devono essere intorno ai 500-200

nucleotidi.

Segmento non completamente marcato, ma che ha pezzi di DNA marcati.

RANDOM PRIMING

quando si hanno sonde molto piccole, nell’ordine dei 8-10 kb, la

nick translation non va bene perché si degraderebbe tutto (dalla

DNasi) non si riuscirebbe ad avere frammenti utilizzabili come

à

sonda.

La random priming è utilizzata per marcare sonde più piccole,

solitamente ottenute mediante Long Range PCR, dell’ordine di 6-8

Kb. Questa tecnica si basa sull’utilizzo di primer multipli, che

riescono a riconoscere tutte le sequenze presenti sul DNA

Klenow,

mediante l’utilizzo di un che ha soltanto attività

polimerasica e non quella esonucleasica (è una DNA polimerasi modificata). Quindi il random priming è una marcatura

enzimatica che utilizza una serie di 9-meri primers degenerati capace di amplificare l’intero frammento di DNA

linearizzato.

Mediante la Klenow si ha la formazione di piccoli frammenti: nella reazione oltre ai nucleotidi normali, ci sono anche

quelli marcati alla fine si ha un mix di frammenti tutti marcati, che poi vengono successivamente utilizzati come

à

sonda.

Infine, è possibile utilizzare anche un altro tipo di approccio, simile alla random priming

DOP-PCR (DEGENERATE OLIGONUCLEOTIDE PCR)

dove si utilizzano oligonucleotidi degenerati (mix di primer) in grado di riconoscere tutte le sequenze. Aggiungendo un

nucleotide marcato mediante Long Range PCR si ha l’amplificazione di frammenti a loro volta marcati. 56

AFFIANCO ALLE MARCATURE DI TIPO ENZIMATICO, ESISTONO ANCHE MARCATURE CHIMICHE

solitamente sono kit commerciali contenenti molecole, ad esempio, con un atomo di platino in grado di legarsi in

maniera specifica sia al DNA sia all’RNA mediante legame con l’azoto della guanina in posizione 6, oppure possono

marcare le proteine attraverso legame con lo zolfo della metionina o di cisteina oppure con l’azoto dell’istidina. Non è

nota la molecola che permette la marcatura perché è un prodotto si trova sul commercio.

Questa metodica però è raramente usata in quanto il costo è più elevato rispetto ad una metodica enzimatica.

FISH: MICROSCOPIO OTTICO A FLUORESCENZA

Possono essere usate lampade a vapori di mercurio oppure lampade a fibre ottiche (quelle più comunemente usate

oggi). Quest’ultima emette un fascio di luce che attraversa il filtro di eccitazione e che attraverso lo specchio dicroico

viene deviato attraverso l’obiettivo/condensatore sul

vetrino.

Poiché sul vetrino sono presenti molecole fluorescenti

queste vengono eccitate e a loro volta emettono una

luce che attraversa il filtro di emissione può essere

à

rilevata attraverso gli oculari dall’osservatore oppure

attraverso una fotocamera o una CCD camera (che

inizialmente veniva utilizzata per osservare le stelle à

sensibilità estremamente elevata). Dopodiché queste

immagini vengono elaborate al computer.

spettro di eccitazione spettro di emissione

Ogni fluorocromo ha uno e uno specifico se si utilizzano nello stesso

à

esperimento più fluorocromi è importante sceglierli in modo tale che lo spettro di emissione non sia sovrapposto, in

modo tale da distinguere bene il segnale emesso da un fluorocromo piuttosto che da un altro.

Il microscopio a fluorescenza è corredato di filtri specifici per i fluorocromi utilizzati per visualizzare la sonda. Al

microscopio è collegata una fotocamera in grado di captare l’immagine vista al microscopio e trasmetterla ad un

computer come immagine in bianco e nero (è in bianco e nero perché

quelle a colori hanno una risoluzione più bassa).

Fotografando la stessa metafase e utilizzando i vari filtri, si ottengono

singole immagini che vengono registrate separatamente e con programmi

appropriati vengono pseudo-colorati.

Esempio: è utilizzata una singola sonda/fluorocromo, i filtri usati sono due:

prima si usa il DAPI, che evidenzia le metafasi e i nuclei in interfase,

successivamente cambiando il filtro si vedono soltanto i segnali

fluorescenti dati dalla sonda. È poi possibile decidere quale colore

associare a questo fluorocromo pseudo-colorarlo e sovrapporlo in

à

modo tale da vedere esattamente i segnali a livello dei cromosomi specifici

riconosciuti da queste sonde. 57

APPLICAZIONI GENERALI DELLA FISH

• Identificazione di anomalie di numero (poliploidie, trisomie, monosomie): non utilizzando le metafasi, ma i

nuclei in interfase

• Identificazione di riarrangiamenti strutturali e loro caratterizzazione:

• MICRODELEZIONI

• MICRODUPLICAZIONI

• TRASLOCAZIONI CRIPTICHE

• INVERSIONI

• CROMOSOMI MARCATORI O AD ANELLO

• Mappaggio cromosomico di una regione specifica: localizzazione di specifiche sequenze geniche su specifici

cromosomi

SONDE

Esistono diversi tipi di sonde che possono essere utilizzate:

Chromosome painting: sonde di DNA costituite da un’ampia collezione di frammenti differenti derivati da un

Ø unico cromosoma colorano completamente il cromosoma. Inizialmente venivano costruite a partire da

à

librerie genomiche plasmidiche cromosoma specifiche (costruite a partire da cromosomi isolati mediante

flow-sorting: venivano sortati i singoli cromosomi, tagliati e clonati in plasmidi) si aveva una libreria formata

à

da una collezione d