Appunti Genetica molecolare umana

DIAGNOSI

In alcuni individui, il quadro clinico è caratteristico di una specifica alterazione della funzione mitocondriale e la

diagnosi può essere confermata tramite il test del DNA.

In molti individui è necessario invece ricorrere ad un approccio più complesso, che comprende:

dell’albero genealogico →

1. L’analisi capire se la mutazione è a carico di un gene midocondriale o nucleare: gli

alberi genealogici saranno completamente diversi (se fosse nucleare la patologia insorgerebbe molto prima

perché tutti i mitocondri sono intaccati) 98

acido lattico:

2. La misurazione della concentrazione di si accumula nei tessuti in quanto è inefficiente la

riduzione dell’ossigeno. Dopo 15 minuti di esercizio fisico, se auemnta notevolmente l’acido lattico significa

che c’è un blocco alla catena respiratoria.

biopsia muscolare

3. La per analisi istologiche

L’analisi molecolare

4. delle basi del mtDNA, qualora sia sospettabile una mutazione a livello del genoma

mitocondriale. L’analisi viene fatta tramite NGS

Le normali funzioni mitocondriali dipendono dalla relazione simbiotica di DNA nucleare e DNA mitocondriale.

L’omeostasi cellulare è sotto il doppio controllo di questi due genomi. Le patologie mitocondriali non possono essere

solo a carico dei geni presenti nel mtDNA, ma possono sorgere da disfunzioni che scaturiscono dall’uno o dall’altro

genoma le mutazioni mitocondriali possono insorgere anche da mutazioni di geni che codificano per proteine che

à

intervengono nell’omeostasi del mitocondrio (codificate da geni presenti nel nucleo).

DUE CLASSI DI MUTAZIONI CHE DANNO ORIGINE ALLE CITOPATIE MITOCONDRIALI

CLASSE 1:

1. coinvolge geni mitocondriali

CLASSE 2:

2. coinvolge geni nucleari

1. CLASSE 1: MUTAZIONI DEL DNA MITOCONDRIALE

- Mutazioni puntiformi → sono in genere ereditate a livello germinale dalla madre

- Riarrangiamenti del mtDNA → le delezioni che coinvolgono più geni sono sporadiche (de novo) avvengono nelle

prime fasi dello sviluppo e coinvolgono le cellule somatiche. Le delezioni possono anche riuguardare una grossa

parte del genoma (1.3-8 kb). Di solito sono talmente gravi che non possono essere trasmissibili perché causano

una patologia molto grave. 99

2. CLASSE 2: I GENI NUCLEARI POSSONO DARE ORIGINE A

- Malattie che coinvolgono la fosforilazione ossidativa: sindrome di Leigh, paraganglioma

- Malattie che coinvolgono geni che intervengono nell’integrità mitocondriale: oftalmoplegia esterna progressiva

(PEO) e sindrome da encefalomiopatia mioneurogastrointestinale mitocondriale

- Malattie che hanno un effetto mitocondriale sulla catena della fosfrilazione ossidativa: atassia di Friedrich, dovuta

alla mutazione di geni nucleari che danno come effetto secondario l’alterazione a carico del mitocondrio (della

catena respiratoria).

APPROCCIO TERAPEUTICO: TECNICA DEI TRE GENITORI

Tre anni fa circa per la prima volta è stata usata una terapia genica in una madre portatrice di una mutazione a carico

di mtDNA: la terapia corregge il difetto dei mitocondri materni. Il primo intervento è avvenuto in Messico dando

origine ad un figlio definito “con 3 DNA”. Togliere dalla cellula uovo della madre i mitocondri mutati.

Esistono 2 tecniche: pro-nucleo:

1. Trasferimento del oocita materno che contiene i mitocondri mutati, fecondato dallo sperma del

padre si genera un pro-nucleo che viene rimosso dall’oocita materno contenente i mitocondri malati e

à

contemporaneamente una cellula uovo di una donatrice che contiene mitocondri sani viene fecondata con lo

sperma dello stesso padre. Viene rimosso il pro-nucleo del donatore e il pro-nucleo dellla donna con

mitocondri malati (la madre) viene inserito all’interno della cellula uovo della donatrice sana

2. Trasferimento del fuso materno: la cellula uovo della madre contenente i mitocondri mutati non viene

fecondata, ma viene rimosso il nucleo, che viene inserito nell’oocita donatore privo del nucleo cellula

à

fertilizzata dagli spermatozoi del padre

In entrambe le situazioni il bambino è il risultato di metà di DNA del padre, metà della madre e contiene anche nel

citoplsma del DNA mitocondriale derivato dalla donatrice → 3 genitori. 100

LEZIONE 8 - 27. 03

MUTAZIONI DINAMICHE Sono mutazioni che avvengono a livello dei

MICROSATELLITI a causa della loro instabilità (short

tandem repeats), ossia sequenze ripetute in

tandem in cui l’unità di ripetizione è compresa tra 1

e 4 nucleotidi. Le STR costituiscono il 3% del

genoma.

I microsatelliti più instabili sono quelli rappresentati da 3 ripetizioni

nucleotidiche, frequenti nel genoma.

Queste ripetizioni trinucleotidiche in alcuni casi sono contenute in geni e

sono definite “mutazioni dinamiche” poiché sono instabili nel corso della

meiosi tendendo ad espandendersi.

In teoria esistono 64 possibilità di sequenze trinucleotidiche, ma tenendo 10 ripetizioni

conto delle permutazioni cicliche e della lettura su entrambi i filamenti, sono possibili solo

trinucletodiche.

Esempi: ripetizione CGG è alla base della sindrome dell’X fragile; ripetizione CAG alla base delle poliglutaminopatie e

della corea di Huntington.

La lunghezza delle ripetizioni trinucleotidiche influenza la loro stabilità in mitosi e in meiosi: al di sopra di un certo

numero queste ripetizioni, se presenti all’interno di un gene, tendono a subire un’espansione oppure una contrazione

(in genere più frequente un’espansione) non verranno mai trasmesse immutate da genitore a figlio: questo

à

giustifica ancora una volta il fatto che vengono definite mutazioni dinamiche.

MECCANISMI DI CONTRAZIONE/ESPANSIONE DELLE RIPETIZIONI

Nel corso della replicazione, se la contrazione/espansione avviene a

livello del filamento di neosintesi (non su quello parentale), si assiste

ad un’instabilità dovuta ad un appaiamento errato del filamento di

neosintesi, che shifta indietro la polimerasi nel corso della

à

duplicazione del DNA fa delle pause, per cui i due filamenti possono

distaccarsi temporaneamente: se il filamento di neosintesi si appaia in

maniera errata, cioè più indietro, viene aggiunta una tripletta.

Nell’immagine il filamento di neosintesi si stacca, shifta indietro e

quindi vengono inserite due ripetizioni R3. 101

Si creano forcine nel corso della replicazione che causano

l’espansione oppure la contrazione (se il distacco

temporaneo avviene sul filamento parentale).

Se la ripetizione è molto lunga questo può avvenire in più

punti causando un’espansione massiva. Nelle espansioni più

grandi intervengono anche meccanismi di crossing over

ineguale (i cromosomi omologhi si appaiano in maniera

errata) si creano gameti in cui si ha un acquisto di

à

ripetizioni oppure una contrazione della ripetizione.

presenza di interruzioni nel tratto ripetuto

La è un altro

fattore importante per mantenere la stabilità della

ripetizione in genere nella popolazione generale la

à

lunghezza delle triplette ripetute è polimorfica ma stabile

perché probabilmente le ripetizioni sono interrotte.

Ad esempio, la ripetizione CAG dopo n ripetizioni è

intervallata da una ripetizione CAT.

La presenza di ripetizioni serve da ancoraggio fanno sì

à

che non si vada incontro al meccanismo di scivolamento

all’indietro nel filamento di neosintesi, non comportando

un incremento del numero di ripetizioni.

Ad esempio, nella sindrome dell’X fragile sono presenti 9 ripetizioni CGG, poi una ripetizione CTG e poi di nuovo un tot

di ripetizioni CGG. La presenza di questa tripletta, CTG, permette di mantenere in sede il filamento di neosintesi

impedendo l’espansione.

Durante la meiosi, alla base di grosse espansioni, come si è detto, si inserisce invece un meccanismo più complesso

dovuto a crossing over ineguale: si possono generare gameti con un acquisto massivo di ripetizioni oppure con una

contrazione (in genere si verifica un’espansione perché si vanno ad osservare i pazienti malati che sono sempre

espansi, piuttosto che i soggetti sani che non presentano la patologia, per cui non si hanno grosse evidenze di

contrazione).

Slide da 6 a 9

MALATTIE DINAMICHE - CARATTERISTICHE COMUNI

• INSTABILITÀ MITOTICA: determina la presenza di espansioni di grandezza differente all’interno dello

stesso tessuto e tra tessuti differenti. Si produce quindi un mosaicismo tissutale.

• INSTABILITÀ MEIOTICA: determina la trasmissione alle generazioni successive di un’espansione di

diversa ampiezza è alla base del meccanismo di anticipazione

à

• TRASMISSIONE PATERNA O MATERNA: in alcune patologie si possono avere espansioni o contrazioni

del numero di ripetizioni a seconda che l’allele sia trasmesso dal papà o dalla mamma

È alla base della trasmissione alla generazione successiva. In alcune patologie (neurovegetative) che compaiono in età

adulta, nella generazione successiva tendono ad anticipare l’esordio della malattia e a peggiorarne la sintomatologia.

102

Questo perché sia nella gametogenesi maschile che femminile possono avvenire errori. Per questo motivo alcune

malattie vengono trasmesse unicamente dal padre o dalla madre. Corea di Huntington → padre. Sindrome dell’X

fragile → madre.

• lunghezza.

La variabilità degli alleli ripetuti dipende dalla loro Le unità ripetute tendono ad aumentare

piuttosto che diminuire

• premutazione:

Presenza dello stato di presenza di uno stato in cui la ripetizione inizia a diventare instabile, ma

non è ancora associata a un fenotipo patologico. In meiosi, a seconda dello stato del genitore tende ad

espandersi e raggiungere lo stato di mutazione completa. In un soggetto premutato l’espansione non è ancora

così grave da causare la malattia ma nel corso della gametogenesi causa instabilità dell’allele, che tenderà ad

espandersi. In una sola generazione si passa da uno stato di portatore ad uno stato ammalato.

• correlazione genotipo-fenotipo:

Difficoltà nel definire la è possibile definire lo stato di premutazione e di full-

mutazione, ma all’interno della full-mutazione è difficile predire quanto grave il fenotipo. È molto difficile

correlare il numero di ripetizioni (genotipo) alla gravità della malattia (fenotipo).

• anticipazione:

Presenza di aumenta la gravità del fenotipo nelle generazioni successive, con maggior severità e

comparsa ad età precoce. I figli di un padre malato avranno più ripetizioni, quindi anticiperanno la malattia,

con un aggra