Appunti Genetica avanzata

GENETICA DELLE POPOLAZIONI

I marcatori sono polimorfismi del DNA, che possono essere di tipologia (mutazioni puntiformi, inserzione,

delezione, É) e di entitˆ diversa. Nella genetica di popolazione si utilizzano polimorfismi che siano tali tra

individui diversi della stessa specie, quindi che possano differenziare individui allÕinterno delle popolazioni.

In generale un marcatore molecolare permette di differenziare delle entitˆ biologiche, che possono essere

anche specie, per cui ci possono essere marcatori che permettono di differenziare una specie rispetto a

unÕaltra. Quindi un marcatore pu˜ avere diversi livelli di risoluzione, a seconda di cosÕ• al livello

molecolare.

Ci sono marcatori specifici per singoli loci e altri pi• generali, distribuiti su tutto il genoma. Abbiamo parlato

dellÕRLFP, ovvero i primi marcatori molecolari utilizzati per discriminare varianti alleliche, che non

permettono di distinguere individui, ma condizioni (sano/malato), nel momento in cui il polimorfismo di

restrizione va a cadere allÕinterno di quello SNP che determina ad esempio il mancato funzionamento di un

gene e di una proteina. Ad esempio una diagnosi di Anemia falciforme pu˜ essere fatta anche con questo

tipo di marcatori, quindi si amplifica il DNA legato a quella zona, si digerisce con enzimi di restrizione e si

vede un pattern di differenti bande che ci diagnostica la presenza del polimorfismo nucleotidico.

Questo, per˜, non ha un livello di risoluzione molto alto da permettere un fingerprinting (identificazione

come fosse unÕimpronta digitale di un individuo), in quanto per questÕultimo occorrono marcatori molecolari

molto pi• variabili, cio• che intanto non siano legati a fenomeni di successo riproduttivo differenziale, cio•

che non abbia un impatto sulla fitness. Quindi marcatori molecolari non legati essenzialmente a geni, ma

legati a regioni intergeniche, non codificanti e perci˜ a impatto minore sulla fitness di un organismo. Questi

marcatori devono essere anche sufficientemente variabili, cio• il tasso di mutazione di queste zone, che

identifichiamo come marcatori per genotipizzare un individuo, rispetto a un altro, dovrebbe anche variare

abbastanza rapidamente, non nellÕarco della vita di un individuo, ma nellÕarco di qualche generazione.

Queste zone furono scoperte nella metˆ degli anni 80 da Jeffreys e furono chiamate regioni Minisatellite,

che corrispondono a zone di DNA ripetuto, in cui cÕ• unÕalta probabilitˆ di incorrere in eventi di crossing

over ineguale. Quindi individui diversi possono aver subito crossing over ineguale e di conseguenza avere un

numero pi• basso o pi• alto di queste regioni ripetute. Per poterle visualizzare occorre il Southern blotting,

una tecnica lunga di ibridazione, non pratica per il fingerprinting e comunque non sono a risoluzione cos“

alta da permettere di genotipizzare in maniera univoca ogni individuo di una popolazione.

Occorre andare su regioni ancor pi• polimorfe, ovvero i zone distribuite a caso nel genoma

Microsatelliti,

(su tutti i cromosomi e in punti diversi), che hanno avuto una duplicazione della stessa corta sequenza (una/

due/tre basi azotate ripetute pi• volte). Queste zone hanno un tasso di mutazione molto pi• alto di una zona

10 10

codificante, o di una zona non codificante che non ha queste caratteristiche, che arriva a / . Le

−3 −4

regioni ai lati di queste zone sono regioni univoche e quindi • facile disegnare dei primer che possano fare

annealing su queste regioni univoche e amplificare la regione interna che contiene questa zona in cui la

ripetizione di uno, due o tre nucleotidi pu˜ variare in numero. Quindi gli alleli di queste regioni sono

differenze di lunghezza dellÕamplificato PCR, che potrebbe essere lungo un certo numero di basi, o due basi

in pi• o in meno, a seconda se il TA invece di essere ripetuto 8 volte, • ripetuto 6 o 10 volte. Questo • il

polimorfismo a carico di queste regioni ed • legato a eventi non di ricombinazione genetica, ma a eventi di

errore della DNA polimerasi (chiamati eventi dello SNP della DNA polimerasi scivolamento durante la

duplicazione del DNA). Questi sono i marcatori ad oggi utilizzati per fare DNA fingerprinting in umano e

anche in altre specie, per fare gran parte degli studi di genetica di popolazione, in un numero estremamente

alto di specie diverse eucariote, dove sono state precedentemente identificate queste regioni (perchŽ

dobbiamo conoscere la zona per disegnarci i primers).

Anche i Minisatellite si trovano in regioni di DNA non codificante e sono zone di DNA ripetute che possono

essere telomeriche o pericentromeriche. Si trovano in regioni definite deserti genici, ovvero regioni in cui ci

sono meno geni e dove tende ad accumularsi un numero di elementi ripetuti. Anche in questo lÕespansione o

contrazione della ripetizione non ha in principio un effetto sulla fitness dellÕorganismo. Quindi la

distribuzione delle frequenze di questi alleli • legata unicamente al caso, ovvero allÕincrocio tra individui, ma

non legato al fatto che certi alleli sono favoriti per la selezione naturale. Questa • lÕipotesi di partenza, ma

non • detto che sia sempre verificata, per˜ • lÕipotesi da assumere per poter calcolare la frequenza con la

quale si pu˜ trovare un certo genotipo in una data popolazione.

Ci sono casi, come la Sindrome dellÕX fragile, in cui lÕespansione di un microsatellite • un fenomeno

patologico, che influenza gravemente la fitness dellÕindividuo. In tal caso, questa zona, chiaramente, non •

legata a studi di genetica di popolazione, ma a indagini di tipo fisiopatologico.

Questo tipo di marcatori • facilmente analizzabile, poichŽ si fa la PCR e poi lÕelettroforesi, non su gel di

agarosio, ma su un capillare di poliacrilammide, perchŽ le differenze tra un allele e un altro possono essere

anche di una sola base e quindi occorre un sistema di elettroforesi che sia in grado di discriminare anche

differenze di una sola base. LÕagarosio, come polimero, non • in grado di discriminare queste differenze;

mentre la poliacrilammide si. Attualmente non si fanno pi• gel di poliacrilammide da molti anni, perchŽ

esistono dei sistemi automatici, in cui la poliacrilammide viene inserita in un capillare e lÕelettroforesi viene

fatta allÕinterno di esso. Sono sistemi automatizzabili e pi• riproducibili.

Una caratteristica importante che differenzia i Microsatelliti da altri marcatori, oltre al polimorfismo, • il

fatto che permettono di evidenziare il genotipo nella sua totalitˆ, cio• permettono di vedere se un individuo

per quel microsatellite • omomozigote (entrambi gli alleli uguali) o eterozigote (alleli differenti). Non tutti i

marcatori sono in grado di evidenziare lÕeterozigote. Quelli che sono in grado di evidenziare lÕeterozigote

vengono chiamati che permettono di identificare entrami gli alleli. I

Marcatori codominanti, Marcatori

invece, permettono di identificare solo un allele, in quanto lÕaltro non • visibile. E quindi sono

dominanti,

marcatori meno informativi, perchŽ posso avere due individui che per i marcatori sono uguali, ma in realtˆ

uno • omozigote e lÕaltro • eterozigote.

Immaginiamo un gel di agarosio: nel secondo pozzetto metto il DNA di un

individuo omozigote e nel terzo pozzetto un individuo eterozigote. Se ho un

microsatellite (T)10 e vedo una sola banda, significa che quellÕindividuo

diploide ha entrambi gli alleli come (T)10. Se per˜ lÕindividuo • eterozigote e

ha il (T)10 e il (T)12, allora avrˆ due bande: una alla stessa altezza della banda

nellÕindividuo omozigote e una un po' pi• alta. Ovvero, quando

Quando un marcatore pu˜ essere dominante per PCR?

diventa impossibile valutare se quella zona amplificata per PCR • presente in

due copie (eterozigote) o in una copia soltanto (omozigote)? Quando la PCR mi

viene, cio•, sono riuscito ad amplificare qualcosa, significa che quellÕallele cÕ•.

Ma non so se ho amplificato entrambi i cromosomi o solo uno.

Se non ho una mutazione nella regione amplificata, ma nel sito di

attacco del primer di un solo cromosoma, un allele (α) mi produce

lÕamplificato mentre lÕaltro (αÕ) no, perchŽ essendoci una

mutazione, il primer non si attacca. In questo caso, quindi, il

secondo allele non lo vedo.

la PCR funziona se ho delle zone che conosco, in

Ricapitolando:

cui i primer possono effettuare un annealing e che siano tra di loro

complementari. Quindi ho un amplificato della regione che si trova

tra i due primers. I primers possono fare annealing allo stampo solo

se questo • complementare, perchŽ altrimenti non si possono

agganciare. Se ho una mutazione nel sito di annealing, ovvero sulla

sequenza del DNA su cui si attacca il primer, viene impedito il

legame di quel primer e quindi avr˜ solamente uno dei due primers

legati e non riesco a fare lÕamplificazione, poichŽ ce ne vogliono due. Di conseguenza la PCR dellÕallele α

mi da un prodotto di amplificazione, mentre la PCR dellÕallele no. Quindi, sul gel, un individuo

αÕ

omozigote, per non mi da nessuna banda, perchŽ per quel marcatore non produce nessun amplificato. Se

αÕ

lÕindividuo fosse eterozigote, produrrebbe sempre un solo amplificato, perchŽ un allele dˆ lÕamplificato,

lÕaltro no.

Quando cÕ• la presenza di una banda, con questa tipologia di analisi, non si sa se • doppia o singola (non

posso distinguere omozigote da eterozigote). Questi marcatori sono chiamati marcatori dominanti.

In un test di paternitˆ utilizzo un marcatore dominante o codominante? Si utilizza un

DOMANDA:

marcatore codominante, perchŽ riesco a discriminare il genotipo. Si ha un livello di risoluzione maggiore.

In genetica di popolazione, scelgo sempre un marcatore codominante, perchŽ mi da pi• informazioni: riesco

a vedere anche lÕeterozigote. Con i marcatori dominanti non posso fare fingerprinting, sono marcatori meno

risolutivi.

Oltre al caso della mutazione sul sito di annealing di uno dei due primers, potrebbe esserci una grande

inserzione nella zona di DNA tra i due primers, che • tale da allontanarli cos“ tanto da non poter dare pi•

origine a un amplificato. Una PCR, in condizioni standard, amplifica fino a circa 3.000 basi, quindi se ho

unÕinserzione che li separa di 10.000 basi, avr˜ un assenza di amplificato, perchŽ sono oltre le dimensioni

compatibili a una reazione di PCR in condizioni normali.

I microsatelliti sono marcatori codominanti, attraverso i quali si pu˜ vedere lÕeterozigote e siccome sono

distribuiti su tanti punti diversi del genoma, abbiamo tanti loci microsatellitali e per ogni microsatellite non

abbiamo due alleli, ma tant