Appunti estesi di Biologia molecolare I

LEZIONE 1→ interazioni tra molecole, amminoacidi

Le macromolecole svolgono attività fondamentali per i processi vitali di un organismo.

Alcune macromolecole detengono l'eredità, ovvero il genoma che contraddistingue ogni

organismo. I complessi processi che avvengono dentro una “unità elementare vitale” cioè

dentro una cellula, sono il risultato di specifiche interazioni tra molecole.

2 organizzazioni cellulari fondamentali:

●​ cellula procariotica: (batterica) → mancanza di compartimentazione intracellulare

●​ cellula eucariotica: nucleo + organelli + componenti cromosomali + mitocondri con

proprio genoma (negli animali) + cloroplasti con proprio genoma (nei vegetali)

Legami covalenti ripartiti per energia di legame

e legami non covalenti:

L’importanza dei legami più deboli nei sistemi

biologici è maggiore rispetto a quelli più forti e

stabili, perché consentono dinamicità che meglio

asseconda i processi biologici fondamentali. Ad

es: il trascrittoma, cioè la forma del DNA

trasformato in RNA, poichè i fattori che si

approcciano ad esso si legano attraverso legami

di questo tipo, assemblando un apparato

molecolare che si adatta alla molecola per

svolgere la sua funzione e poco dopo aver agito

dissolversi.

legami a H (di natura elettrostatica)

★​ interazioni dipolo-dipolo= la capacità di

★​ attrazione in questo caso è efficace solo

quando le molecole sono vicine (tra basi

complementari nella doppia elica del

DNA si formano 2/3 legami di questo

tipo)

attrazione ione-dipolo= spiega la

★​ solubilità delle sostanze saline in acqua

e nei liquidi polari

interazioni di Van der Waals

★​

I protoni dei gruppi ossidrilici (-OH) e dei gruppi

amminici (-NH ) sono buoni donatori di elettroni all’interno dei legami a H.

2

Il DNA sta insieme basandosi sulla cooperatività di tanti eventi di interazione/ attrazione.

Esiste una distanza ottimale alla quale avviene una giusta interazione tra 2 molecole, infatti

comprimendo la distanza tra 2 molecole si viene a creare una repulsione reciproca tra gli

orbitali. Questa distanza non è fissa ma dinamica, infatti l’avvicinamento o il distaccamento

può determinare la conclusione di un processo come ad esempio l’interazione tra un enzima

e un altra molecola, inducendolo a stoppare la sua azione.

Gli amminoacidi

E’ importante conoscere le strutture al fine di riconoscere come agiscono nei processi e

poterli disegnare. L’ossatura di una proteina deriva dalla progressiva polimerizzazione

basata sul legame peptidico (nascono quindi come molecole lineari), che porta al

ripiegamento e all’assunzione di forme tridimensionali (es: globulare). Questo legame non

preclude nessuna associazione di amminoacidi, come risultato si ottiene un numero enorme

di combinazioni e di altrettante funzioni e strutture. La forma ad di alcune proteine

Ⲁ-elica

espone le catene laterali degli amminoacidi poiché saranno loro che leggeranno la sequenza

del DNA. I foglietti disponendosi ravvicinati, possono creare un canale attraverso il quale

,

può passare un soluto (es: canali ionici) o determinare un compartimento intracellulare.

LEZIONE 2→ DNA: polifosfodiestere

I sostituenti esposti dagli anelli aromatici sono i protagonisti delle interazioni (deboli) tra

nucleotidi. Il resto del nucleotide è importante per il riconoscimento della base

complementare; le altre parti hanno lo scopo di venir lette da proteine che leggono la

sequenza.

Nucleotide dell’RNA con ribosio con gruppo ossidrilico sul C2

Nucleotide del DNA con ribosio senza gruppo OH sul C2 (desossi-)

I carboni del ribosio e le loro funzioni:

attacca la base

⇢C1 discrimina i 2 acidi nucleici

⇢C2 fondamentale nella polimerizzazione degli acidi nucleici

⇢C3 non tanto fondamentale

⇢C4 fondamentale perché ha un gruppo ossidrilico che nei nucleotidi è esterificato ad un

⇢C5

gruppo fosfato (componente acida).

Basi azotate:

pirimidiniche: hanno un

➢​ anello a 6 termini; in questo

tipo di basi variando il

sostituente in posizione 4, 2 e

5, si hanno basi differenti

(citosina con gruppo

amminico primario, timina e

uracile con gruppo osso)

puriniche: hanno 2 anelli

➢​ condensati, uno a 5 e uno a 6

termini, (adenina e guanina),

differiscono per i sostituenti in

posizione 4 e 2 dell’anello a 6

termini

Questi composti sono quelli fondamentali ma hanno delle varianti poiché reagiscono

chimicamente. La timina e la guanina, ad esempio, si possono trovare oltre che in forma

chetonica, anche (ma con meno probabilità) in forma enolica, questo interferisce con il

riconoscimento della base stessa da parte di proteine che le devono leggere. L’adenina e la

citosina invece si possono trovare in forma amminica oppure imminica.

Nei nucleotidi l’acido fosforico va a formare

un legame estere (debole), diventando un

gruppo fosfato; l’idrolisi di questo legame è

probabile, perché favorita energeticamente.

La pirofosforolisi è esattamente l’opposto

della formazione del legame fosfodiestere

ed avviene attraverso attacco nucleofilo di

un pirofosfato inorganico al fosfato di un

legame fosfodiesterico.

Invece il legame N-glicosidico che collega

l'azoto della base azotata al C1 del ribosio è

molto forte, per questo strappare basi al

DNA richiede grande energia o catalizzatori

(depurinazione catalizzata da enzimi).

La reattività dei gruppi fosfato

potenzialmente legati allo zucchero non è

la stessa. Il primo (PⲀ) rimane attaccato

allo zucchero, mentre P e P vengono

rilasciati come pirofosfato e da questa

reazione si ricava l’energia sufficiente per

la polimerizzazione dei nucleotidi.

Nucleosidi= base + zucchero (senza

gruppo fosfato)

La formazione del legame fosfodiestere (su cui si basa la

polimerizzazione) avviene attraverso l’attacco nucleofilo

dell’ossidrile al fosfato in posizione Questo attacco

Ⲁ.

può avvenire solamente ad un nucleotide trifosfato

(infatti gli unici possibili precursori sono nucleotidi

trifosfato, gli altri non sono adatti alla polimerizzazione).

La catena che si viene a formare è polarizzata, infatti

negli acidi nucleici si riconoscono le estremità 5’ (che

espone il fosfato) e 3’ (con -OH libero) e la direzione di

formazione è sempre 5’ → 3’. Non ci sono vincoli alla lunghezza della polimerizzazione e

questo spiega il perché di cromosomi con un

numero altissimo di basi in alcuni organismi

complessi; non ci sono vincoli nemmeno

nell’assortimento delle basi nel filamento singolo.

Formazione di legami H tra le basi complementari

La distanza tra di esse è di pochi Armstrong. Al

variare del pH le interazioni si modificano e le basi

si distaccano, come ad esempio in ambiente

alcalino dove il soluto tende a strappare protoni ai

gruppi donatori. Giocando con l'orientamento

reciproco può

avvenire (con

bassa frequenza)

l’appaiamento di

basi non

coppie di Hoogsten, tipo: A-A o A-T e T-C.

complementari,

Queste alterazioni sono possibili in vitro.

Le regole di Chargaff impongono che la quantità di purine

deve sempre equivalere a quella delle pirimidine.

I filamenti che si appaiano nel DNA sono in posizione antiparallela.

Intercalazione=

Il fenomeno dell’interposizione di composti (solitamente cancerogeni perché perturbano la

stabilità della doppia elica) è raro per via della sovrapposizione delle basi ad una distanza

molto ravvicinata, ma in modo da non respingersi reciprocamente.

Le basi devono essere complanari cioè devono

giacere sullo stesso piano, per poter essere

correttamente appaiate, se sono distorte o

ruotate non possono dare luogo all’impilamento

corretto.

Esistono 3 strutture ipotizzate per la

spiralizzazione della doppia elica. Nei sistemi

biologici (nella realtà) si trova solamente la

struttura B, in condizioni particolari si può

riscontrare la A, mentre la struttura Z è

biologicamente impossibile.

B→

Nella struttura prevalente il centro della

doppia elica (dove giacciono i legami H tra le

basi) è piena e compatta, non cava, le uniche

parti cave sono i solchi formati dai legami

N-glicosidici. Ci sono 10 coppie di basi a giro

d'elica, per un totale di 34 Å di lunghezza, quindi una base dista dall’altra 3,4 Å. I piani delle

basi sono paralleli (l’angolo di roll è nullo), ma l’orientamento no, infatti una base rispetto

all’altra è ruotata di 36°, il che ottimizza l'impilamento, minimizzando la repulsione reciproca.

A→

Il suo asse longitudinale è esterno rispetto alle interazioni delle basi appaiate, quindi la

struttura è cava; questa può verificarsi nell’ibrido DNA-RNA. Ha 11 coppie di basi a giro

d'elica. Il passo è rimpicciolito quindi le interazioni sono sfavorite; una base rispetto all’altra è

ruotata di 34° e dista 2,3 Å. Complessivamente questa struttura è più stabile ma ha un

assetto poco accessibile. L’angolo di roll è 19° e determina la curvatura dell’elica.

Z→

La struttura ha un orientamento delle basi rispetto al ribosio che non è sempre quella

canonica, di tipo anti, ma può essere anche di tipo sin (base non esposta all'esterno della

catena), il che distorce completamente le caratteristiche della spirale, che è sinistrorsa (si

avvolge in senso opposto= antiorario), più compatta e più corta delle altre. Ha 12 coppie di

basi a giro d'elica. L'angolo di roll può essere sia negativo che positivo, con un valore di -9°

per le coppie di basi puriniche e +7° per le pirimidiniche.

LEZIONE 3→ Proprietà chimico-fisiche del DNA:

●​ idrolizzabile da acidi e resistente agli alcali

●​ densità

●​ intercalazione

●​ denaturazione: esiste un punto di temp critico oltre il quale perde la sua integrità

Il pH dell’ambiente intracellulare eucariotico è neutro e non comporta alcun rischio di idrolisi

per la molecola di DNA, ma nel momento in cui la molecola viene sottoposta ad ambienti

non neutri, è osservabile che questa è più resistente agli alcali (dai quali non viene

idrolizzata) rispetto che agli acidi.

L’unico effetto che produce un pH alcalino al DNA è la denaturazione reversibile. I ponti H

della molecola necessitano della protonazione dei gruppi amminici, quando questi vengono

meno non vi è più attrazione e si rompono. Invece l’RNA in soluzione basica si idrolizza.

In ambiente acido invece va incontro ad idrolisi: in primo luogo si scindono i legami

fosfodiesterici, a lungo termine si idrolizzano anche i legami N-glicosidici.

MECCANISMO DI IDROLISI sul DNA

In presenza di un acido, quindi di protoni liberi, l’ossigeno che deriva dal fosfodiestere tra il

3’ della base precedente e il fosfato che connette la base seguente, va a reagire con i

protoni liberi. A questo punto il fosfato viene ad essere disponibile per l’interazione con l’O di

una molecola d’acqua, che va a concludere l’idrolisi, portando alla formazione di un ossidrile

libero e un fosfato attaccato al C5 della base del nucleotide seguente. Questo meccanismo

è catalizzato da tutti gli enzimi con attività nucleasica sul DNA, lasciano degli OH sul fosfato.

MECCANISMO DI IDROLISI sul RNA

In presenza di una base capace di attrarre il protone, l’O dell’ossidrile sul C2 reagisce col

fosfato del fosfodiestere; si crea un intermedio in cui il fosfodiestere è un ciclo abbastanza

instabile, tale che una molecola d’acqua lo può scindere e liberare un gruppo fosfato sul C3

dello zucchero (si ottiene un 3’ fosfato).

fase: il fosfodiestere lineare tra 2 nucleotidi diventa un diestere ciclico (O- reagisce con P

1

creando un legame covalente dell'intermedio di reazione), ovvero un composto instabile

fase: questa struttura si risolve spontaneamente reagendo con l’acqua basica, aprendo

2

uno dei 2 esteri sul ribosio. Questa reazione viene considerata una pirofosforolisi, perché un

pirofosfato, ovvero 2 gruppi fosfati concatenati tra loro (diestere), sono in grado di effettuare

una lisi del legame fosfodiesterico. Il DNA è una molecola stabile, tanto che, anche in un

sistema di cellule morte le tracce biologiche, (come saliva) contengono intatto il DNA, ma

diventa instabile in presenza di pirofosfato; eliminando il pirofosfato si ha una condizione

stabile.

Conserviamo il DNA in sistemi tampone (=coppia acido-base coniugata che riesce a

mantenere un pH costante) per evitare l’idrolisi. Si utilizza spesso in ambito biologico il

tampone fosfato (contiene solo monofosfati).

Densità 3

è di circa 1.7g/ . La tecnica per determinare la densità è la centrifugazione all’equilibrio o

isopicnica in gradienti di densità. Si usano i gradienti di CsCl (cloruro di cesio). Permette di

isolare in purezza il DNA da una miscela composta da tutte le macromolecole cellulari.

Questa tecnica prevede:

-​ rompere le cellule

-​ mettere un lisato crudo sopra una soluzione caratterizzata da un gradiente di densità

(molto denso infondo e meno denso man mano che si sale)

-​ sottoporre a centrifugazione

Il DNA si separa dal resto perché è più denso delle proteine; inoltre la sua densità ha una

minima variabilità in funzione della sequenza e dello stato di conformazione, quindi questa

tecnica permette anche di isolare forme più o meno compatte di DNA.

Intercalazione

Uno dei più noti agenti intercalanti è “l'etidio di

bromuro” una molecola planare, idrofobica,

composta da 3 anelli aromatici condensati, con un

ulteriore ciclo ortogonale, connesso attraverso un

singolo legame. Grazie a questi cicli l'etidio

bromuro “ricalca” la forma delle basi complementari

e, grazie ai suoi sostituenti amminici è anche in

grado di reagire con i sostituenti della basi.

Il processo di intercalazione di questo composto

non è ben tollerato dalle cellule infatti è altamente

cancerogeno perché alterando la struttura del DNA, va a perturbare la corretta esecuzione di

eventi come duplicazione e trascrizione. E’ una molecola che è facilmente permeabile

attraverso le membrane.

Inoltre è una molecola fluorescente, irraggiandolo con una radiazione ultravioletta, viene

eccitata ed emette a sua volta una radiazione a lunghezza d'onda minore, ma visibile. Il DNA

normale assorbe ma non emette le radiazioni, mentre con l’etidio di bromuro le riflette.

Gli intercalanti possono interferire anche con il superavvolgimento della molecola di DNA.

Lo spettro di assorbimento del DNA

In rosso il tracciato dell’assorbimento del

DNA riscaldato (quindi denaturato). In blu il

tracciato di assorbimento del DNA nativo.

E’ possibile vedere qual è la lunghezza

d’onda alla quale il DNA ha la massima

capacità di assorbimento delle radiazioni=

260 nm. La capacità di assorbire questa

radiazione è proporzionale all’aumento

della temperatura fino ad un certo punto,

dove raggiunge un valore che rimane

costante anche continuando a riscaldare.

Questa transizione, cioè incremento di

assorbimento viene definito effetto ipercromico.

Questo avviene perché scaldando, si va ad

aumentare l’energia cinetica della molecola;

quando l’energia comincia ad essere

paragonabile e poi superiore a quella che tiene

insieme la doppia elica, vengono rotti i legami H

tra le basi complementari, causando la

separazione dei filamenti. Avendo il doppio

filamento aperto, ognuno espone le basi e quindi

si ha un maggior accesso alla radiazione da parte

di tutte le basi, non si schermano più a vicenda ma è massimizzata la probabilità di

intercettare la luce. Grazie allo studio di questa transizione si può capire la stabilità e la

complessità delle sequenze di DNA.

Forza ionica = parametro legato alla concentrazione di sali disciolti nella soluzione.

La T di denaturazione si innalza all’incremento dei sali presenti, perché questi stabilizzano la

doppia elica. Per confrontare 2 curve bisogna mantenere costante la concentrazione salina!

Nella curva sigmoide di denaturazione la temperatura di melting rappresenta un flesso.

Sulle ordinate→ assorbimento degli ultravioletti

Sulle ascisse→ T= temperatura; Da cui si può

ricavare la T di melting (fusione) corrisponde

alla T alla quale il 50% della doppia elica è

stata denaturata.

Ogni curva rappresenta un DNA esposto ad

una soluzione con differente concentrazione

salina (di un sale completamente dissociabile),

con maggiori conc. verso dx. Tutte le curve

hanno un punto di flesso diverso, cioè ogni

DNA si denatura a T diverse (sempre più alte). I sali ritardano la denaturazione del DNA; ad

alti sali la doppia elica è più stabile, perché:

-​ gli ioni interagiscono con i sostituenti liberi delle basi

-​ lo ione con carica positiva trova un partner efficace nel fosfato dello scheletro per

creare un’interazione stabilizzante che rende più difficile aprire la doppia elica

Infatti, nel grafico è visibile un progressivo spostamento del punto di fusione a T sempre >.

EFFETTO DELLA COMPOSIZIONE IN BASI

Con DNA contenenti sequenze differenti si possono

costruire queste “rette sperimentali".

Sulle ordinate→ contenuto di Guanina e Citosina (si

usano queste 2 perché è la coppia di basi che dà il

maggior contenuto di stabilizzazione, cioè maggior