Appunti esame Genetica umana

Genetica umana

Com'è fatto il genoma umano?

Il genoma umano è organizzato in coppie di cromosomi, 23 coppie in tutto. I membri di ciascuna coppia si chiamano cromosomi omologhi. Di queste 23 coppie di cromosomi, 22 coppie sono definite autosomiche e 1 coppia è la coppia dei cromosomi sessuali (XY nei maschi XX nelle femmine). I membri di ciascuna coppia sono ereditati uno dal genitore paterno e l’altro dal genitore materno. Questo vale anche per le coppie di cromosomi sessuali. Ovviamente, il maschio trasmette il cromosoma Y mentre la femmina trasmette l’X nel caso di un figlio maschio. Mentre nel caso di una figlia femmina sia il papà che la mamma trasmettono l’X.

Genoma nucleare e genoma mitocondriale

Inizieremo a parlare di genoma nucleare. Il genoma mitocondriale è molto più piccolo di quello nucleare. In questa figura, il genoma nucleare viene rappresentato con un insieme di sequenze che possono essere altamente conservate o poco conservate. Possiamo parlare di conservazione nel momento in cui confrontiamo genomi di specie diverse. Le sequenze conservate sono quelle che si mantengono simili tra specie diverse. Invece, le sequenze poco conservate sono quelle che tendono a differire tra specie diverse.

Le sequenze altamente conservate è molto probabile che siano quelle che abbiano un maggiore significato funzionale e quindi nel corso dell’evoluzione sono cambiate poco. Le sequenze poco conservate sono quelle che hanno un significato funzionale meno rilevante e quindi sono libere di mutare senza che queste mutazioni vengano eliminate dalla selezione. La diversità di conservazione non dipende tanto dalla diversità del tasso di mutazione tra queste due classi di sequenze ma dipende sostanzialmente da quanto le mutazioni, che avvengono più o meno con la stessa frequenza, sono eliminate dalla selezione purificatrice.

Tra le sequenze altamente conservate ci sono i geni che codificano per le proteine, i geni che codificano per RNA, geni che codificano per sequenze di regolazione. Quindi, queste sono tutte sequenze che se cambiano possono causare problemi e quindi le loro mutazioni risultano contro-selezionate. Questa parte altamente conservata del genoma è molto piccola. L’1,1-1,2% del genoma viene trascritto e tradotto. Quindi, la porzione codificante proteine del genoma umano è soltanto l’1,1%.

Il 4% del genoma è rappresentato da altre sequenze altamente conservate che vengono trascritte ma che non vengono tradotte. Comunque, sono altamente conservate perché sono molto importanti. Oppure sono sequenze che non vengono trascritte ma sono conservate perché appunto sono sequenze di regolazione. Ora, mentre l’1,1% è una percentuale abbastanza “pulita”, nel senso che è stata ben appurata, questo 4% è in realtà ciò che noi intendiamo con “altamente conservato”.

Infatti, come sappiamo quasi tutto il genoma è trascritto. Questo tanto tempo fa non si pensava ma ora si sa che è così. Però, non tutto il genoma trascritto poi è altamente conservato perché magari i trascritti non sono rilevanti da un punto di vista funzionale oppure perché semplicemente non sono conservati. Quindi, questo 4% lascia un po’ il tempo che trova. La restante parte del genoma nucleare comprende sequenze poco conservate: il 45% del genoma è composto da trasposoni, il 6,5% del genoma è composto da DNA di tipo eterocromatico ossia DNA altamente condensato e generalmente poco trascritto e povero in geni.

Il 44% del genoma invece non rientra in nessuna di queste categorie cioè vi sono porzioni che non fanno nulla, tanti RNA che vengono trascritti e non tradotti e comunque vengono trascritti ma non sono conservati e così via. Bisogna avere un’idea di quanto sia grande un genoma umano. Il genoma umano è grande 3,1 Gb (3,1 miliardi di basi). All’interno di una cellula diploide c’è il doppio di questa quantità quindi 6,2 Gb (6,2 miliardi di basi).

Distribuzione e caratteristiche del genoma

Abbiamo detto che ci sono 23 o 24 diverse molecole di DNA, 23 nella femmine che ha 2 X e 24 nel maschio che oltre agli autosomi ha X e Y. Il numero di molecole di DNA, di cromosomi è 46 nelle cellule diploidi e 23 nelle cellule della linea germinale dopo la meiosi (cellule aploidi). Il genoma nucleare è associato a proteine di vario tipo, sia istoniche che non istoniche. Il numero di geni che codificano per proteine è 20.000. Ma i geni totali non comprendono solo questi codificanti. Infatti, ci sono anche geni per RNA e il numero di questi geni è molto più incerto. Man mano che gli studi avanzano il numero predetto è sempre più elevato.

È anche difficile capire cosa sia un singolo trascritto non codificante. Comunque, sicuramente i geni per RNA sono molti più di 6.000. Un altro parametro importante è la densità genica: c’è 1 gene ogni 120.000 basi. Questa però è una media. Infatti, ci sono regioni con molta più o molta meno densità genica. Quindi, sono misure più incerte. I geni non sono distribuiti in modo omogeneo nel genoma. Oltre il 50% del genoma è costituito da DNA ripetitivo. Il DNA ripetitivo comprende sia i trasposoni (ossia elementi ripetuti interspersi nel genoma, tipo l’elemento Alu) sia il DNA eterocromatico (composto da blocchi di sequenze ripetute in tandem) ma ci sono anche delle famiglie geniche in cui ci sono più geni simili ripetuti uno dopo l’altro, oppure ripetuti in diverse porzioni del genoma.

Quindi, il genoma è in gran parte ripetuto. Per quanto riguarda la trascrizione ci sono diverse eccezioni ma in generale i geni sono trascritti in modo indipendente l’uno dall’altro (questo nell’uomo). Quindi, i geni sono spesso trascritti in modo indipendente. Gli introni sono presenti nella maggior parte dei geni umani. La percentuale di DNA che codifica per proteine è circa l’1,1-1,2% (come visto in precedenza). Il codice genetico umano è come quello della maggior parte degli eucarioti superiori. Ha 64 codoni (4³), quindi 4 basi organizzate 3 a 3.

Quindi, ci sono 64 possibili combinazioni di 4 basi prese 3 a 3. Di questi 64 codoni, 3 sono i codoni di stop. Quindi 61 sono i codoni che codificano per i 20 amminoacidi. Il codice genetico è degenerato. Questo vuol dire che uno stesso amminoacido è codificato da più codoni diversi. Nel genoma nucleare, non in tutto, c’è ricombinazione. Non in tutto perché ad esempio gran parte dell’Y non ricombina perché non ha un partner con cui farlo ma è argomento che vedremo poi in maniera più approfondita. Altra cosa rilevante è il tipo di ereditarietà che nell’uomo è di tipo mendeliana sia per l’X che per gli autosomi mentre il tipo di ereditarietà è paterna per l’Y, che viene trasmesso solo lungo le vie di discendenza paterna. Il DNA mitocondriale è trasmesso solo per via materna.

Trasposoni

Andiamo più nel dettaglio del genoma soffermandoci sui trasposoni. Circa il 45% del genoma umano è rappresentato dai trasposoni. Cosa sono? Sono elementi mobili del genoma che si spostano da una porzione all’altra del genoma con modalità differenti. Queste modalità sono: il copia e incolla (il trasposone rimane nel sito originario ma viene anche messo in un’altra porzione del genoma) e il taglia e incolla (il trasposone viene esportato dal sito originario in cui non c’è più ed è trasposto in un’altra regione del genoma). La maggior parte dei trasposoni che si trovano nell’uomo sono di tipo copia e incolla e solo una piccola parte sono di tipo taglia e incolla.

Vi sono due grandi classi di trasposoni nell’uomo: trasposoni a RNA (o retrotrasposoni) e trasposoni a DNA. I trasposoni a RNA sono di tipo copia e incolla. I trasposoni a DNA sono invece di tipo taglia e incolla. I retrotrasposoni comprendono tre classi: LINEs, SINEs ed elementi simili a retrovirus (HERVs). Invece, esiste un’unica classe di trasposoni a DNA.

LINEs, SINEs e HERVs

I LINEs (long interspersed nuclear elements) sono elementi nucleari interspersi lunghi. Sono elementi lunghi nell’ordine delle Kb. Sono autonomi ossia non hanno bisogno di altri elementi per potersi trasporre. Contengono un promotore interno per la RNA pol II. Nel momento in cui il trasposone traspone si sposta con esso anche questo promotore. Inoltre, questo elemento oltre al promotore contiene anche due ORF ossia ORF1 e ORF2 che codificano per due proteine. Di queste due proteine una è una proteina che si lega all’RNA che viene trascritto a partire dal trasposone mentre l’altra è una proteina che ha una doppia funzione fondamentale per il trasposone stesso e cioè funziona da endonucleasi e da trascrittasi inversa.

Nel momento in cui l’RNA viene trascritto sicuramente viene trasportato nel citoplasma perché deve essere tradotto (visto che ha queste ORF) ma poi l’RNA può ritornare nel nucleo dove eventualmente può integrarsi nel DNA. Ma come riesce a far ciò? Si integra operando un taglio sfalsato sul DNA con l’endonucleasi. A questo punto a livello del taglio viene sintetizzato il DNA che viene copiato a partire dall’RNA. Quindi, a questo punto interviene questa trascrittasi inversa che trascrive da RNA a DNA. Questo meccanismo è molto complicato ma non entreremo nel dettaglio.

Come gran parte degli RNA i LINEs presentano una coda di adenine al 3’. Quando si inseriscono nel genoma, come conseguenza del fatto che fanno un taglio sfalsato del genoma, ed entrambi queste porzioni di DNA a singolo filamento poi vengono riempite, all’estremità del LINE si produce una duplicazione. Quindi, laddove si inserisce il LINE io avrò una sequenza 7-20 basi da una parte e che ritrovo anche all’altra estremità del LINE. Però, sono sequenze del genoma: è la parte del genoma che è stata tagliata in modo sfalsato.

Spesso queste LINEs sono incomplete. Il 99% delle copie è incompleta perché mancano le porzioni al 5’ dell’elemento in quanto non vengono retrotrascritte completamente. Quindi, il trascritto magari è anche completo ma quando viene retrotrascritto nell’altra direzione non si arriva fino al 5’. Tutte queste classi LINEs, SINEs ed HERVs sono ulteriormente suddivisibili in famiglie. Nelle LINEs distinguiamo tre famiglie principali nell’uomo: L1 (l’unica attiva dal punto di vista della trasposizione), L2 e L3. All’interno della famiglia L1 in realtà ci sono pure delle sottofamiglie, e soltanto alcune di queste sottofamiglie sono a loro volta attive. Quindi, alla fine di tutto questo grandissimo numero di LINEs (850.000) solo 100 sono attive per quanto riguarda la possibilità di retrotrasposizione. Un conto è la capacità di retrotrasporsi e un conto è la possibilità di essere trascritti. In realtà, gran parte dei LINEs vengono trascritti e non necessariamente a partire dal loro promotore però poi quelli che veramente sono in grado, oltre di essere trascritti, di essere retrotrascritti e integrarsi nel DNA sono soltanto 100.

I SINEs (elementi corti nucleari interspersi) sono elementi molto più corti: 100-400 basi. Sono elementi non autonomi. Da un punto di vista evolutivo questi retrotrasposoni vengono da tRNA. Quindi, sono tRNA che si sono evoluti come retrotrasposoni. Contengono un promotore interno per la pol III (che è la stessa che trascrive il DNA in tRNA). Anche questi presentano una coda di poliA terminale. Poi anche questi nel momento in cui si inseriscono nel genoma (per lo stesso motivo che abbiamo visto nei LINEs) producono alle estremità delle ripetizioni terminali dirette. Non sono autonomi quindi non codificano per proteine. Per la retrotrasposizione usano le proteine prodotte dagli elementi LINEs. Anche qui ci sono diverse famiglie di SINEs come, ad esempio, i MIR (mammalian-wide interspersed repeats) e i MIR3.

Però la classe assolutamente più importante della quale parleremo estesamente è la classe detta Alu. Gli elementi Alu sono una specifica famiglia di SINEs. Questo elemento Alu è derivato da un particolare RNA: l’RNA 7SL. L’RNA 7SL fa parte di un complesso ribonucleoproteico che si chiama particella di riconoscimento del segnale che interviene nella traduzione a livello del reticolo endoplasmatico. Sono elementi dimerici come vediamo in figura.

I due monomeri sono separati da una regione interna ricca in adenina. Anche qui l’inserzione inizia in corrispondenza di un taglio catalizzato appunto dall’endonucleasi di L1. Questo taglio avviene in corrispondenza di regioni in cui c’è un poliT. Questo poliT viene sfruttato dall’elemento Alu con il suo poliA. Quindi, l’elemento Alu si appaia con il suo poliA al poliT e da qui inizia la retrotrascrizione. Gli elementi Alu sono molto importanti. Infatti, sono molto frequenti nel genoma umano. Inoltre, sono gli unici elementi SINEs attivi da un punto di vista della trasposizione.

Parliamo dell’ultima classe ossia degli HERVs. Qui quello che è successo è che un retrovirus o verosimilmente più retrovirus hanno infettato gli esseri umani e si sono integrati nella linea germinale (necessariamente perché altrimenti non li ritroveremmo oggi). Si sono anche un po’ modificati infatti adesso non sono più retrovirus attivi dal punto di vista dell’infezione. Nonostante ciò, mantengono al loro interno tre tipici geni virali: gag, pol ed env. I geni gag e pol codificano per una proteasi, una trascrittasi inversa, una RNAasi H e un’integrasi. Quindi, sono geni che codificano per più proteine. Spesso non sono funzionali. Esternamente a questa ragione in cui ci sono questi geni ci sono le LTR. Le porzioni LTR (ripetizioni terminali lunghe) sono all’interno dei trasposoni, si traspongono insieme a loro. All’interno di queste LTR si trovano delle regioni di regolazione della trascrizione. La presenza di tali elementi di regolazione è particolarmente importante perché questi elementi sono rilevanti per l’espressione dei geni gag, pol ed env. Inoltre, questi elementi sono importanti anche eventualmente per l’attivazione della trascrizione di altri geni (non di tipo retrotrasposoni) che si vengono a trovare nelle vicinanze. Quindi, sono elementi funzionali, non sempre ma spesso. Spesso questi LTR si trovano come elementi solitari.

Ciò è molto frequente perché spesso questi elementi LTR fiancheggianti la porzione centrale ricombinano tra di loro. Quindi, essendo elementi ripetuti in modo diretto si ricombinano tra di loro. Quello che succede è che viene deleta la parte intermedia e rimane solo l’LTR. Questo LTR che rimane presenterà una porzione al 5’ dell’LTR di sinistra e una porzione al 3’ dell’LTR di destra. Sono molti nel genoma: 450.000. Molti di questi sono trascritti ma pochissimi sono in grado di retrotrasporsi. La loro rilevanza funzionale non si limita alla loro possibilità di retrotrasporsi ma hanno, come vedremo, anche altre funzionalità nell’uomo.

Trasposoni a DNA

Parliamo ora dei trasposoni a DNA. Qui le differenze sostanziali sono intanto che non vengono retrotrascritti in quanto sono trasposoni a DNA. Si traspongono con un meccanismo di taglia e incolla. Al loro interno ci può essere una trasposasi (che catalizza la trasposizione). Ma nella maggior parte dei casi questa trasposasi è inattiva oppure anche assente. Ciò che si sa è che alcuni geni che si trovano nel nostro genoma si sono evoluti a partire da trasposoni a DNA. Esempi sono: le ricombinasi RAG1 e RAG2 e la proteina centromerica CENPB. Il numero di elementi è molto elevato ma sono tutti elementi molto antichi. Rappresentano i cosiddetti “relitti evolutivi”.

Soltanto una parte dei trasposoni sono in grado di trasporsi: L1 per i LINEs, gli Alu per i SINEs e SVA (ossia una classe di trasposoni, di cui parleremo in relazione alla variabilità). Gli elementi SVA sono esclusi da questa classificazione in quanto sono una specie di “via di mezzo”. Questo grafico è relativo a un paper che venne pubblicato nel 2001 nel momento in cui si sequenziò per la prima volta il genoma umano. Nel 2003/2004 abbiamo avuto una versione più vicina alla realtà. Sono date importanti che rappresentano punti di svolta della nostra conoscenza di questa disciplina. Nel 2001 esce su Nature questo articolo. Contemporaneamente su Science viene pubblicato da una company privata un altro articolo. In entrambi i casi si tratta di articoli di 200 pagine in cui si tira fuori una quantità enorme di informazioni, alcune del tutto rivoluzionarie su quella che è proprio la struttura del genoma umano.

Questo è un esempio di che tipo di analisi si è potuto condurre partendo dalle informazioni che si avevano sul genoma per quel che riguarda i trasposoni. In questa immagine è raffigurato un allineamento multiplo di sequenze. Possiamo immaginare che ogni riga è una porzione di un elemento Alu. Questi Alu avendo un’origine comune sono molto simili tra loro e hanno regioni di omologia e quindi li possiamo allineare gli uni con gli altri. Una volta che sono stati tutti allineati, è possibile trovare la cosiddetta sequenza di consenso. Ossia è possibile trovare la sequenza che meglio di tutte rappresenta l’allineamento. Quindi, ciascun elemento Alu differirà per una certa percentuale delle posizioni dalla sequenza di consenso. Tale sequenza di consenso potrebbe rappresentare una sorta di sequenza ancestrale. Quindi, andare a vedere qual è la divergenza delle sequenze dalla sequenza di consenso mi dà un’idea di quanto tempo è passato dal momento in cui queste sequenze si sono evolute a partire da un antenato unico. La diversità tra sequenze è dovuta a mutazioni: tanto più tempo trascorre da che le sequenze si separano dal punto di vista evolutivo tanto maggiore sarà i