Appunti di Patologia

FLOP»).

Fasi dell’apoptosi

1. Priming 3. Frammentazione (corpi apoptotici)

2. Alterazioni nucleari 4. Fagocitosi

Vie di segnalazione

1. Via estrinseca: Interazione di alcuni recettori con in loro ligandi (R-FAS con FasL, recettore

del TNF- α)

2. Via intrinseca: Attivata da diversi tipi di stress intracellulari (ER stress, danno al DNA).

Ruolo dei mitocondri

3. Mediata da perforina/granzima B: Interazione di linfociti T citotossici (o altre cellule

dell’immunità) con il bersaglio cellulare, rilascio del granzima b

La via estrinseca può convergere nella via intrinseca. Tutte e 3 portano ad una attivazione delle

caspasi

Caspasi (cistein-aspartasi)

Proteasi che hanno una cisteina (c-) nel sito attivo e tagliano proteine bersaglio a livello di residui di

acido aspartico (-asp-). Si attivano per taglio proteolitico

Caspasi Iniziatrici: coinvolte nelle prime fasi dell’apoptosi

(es: se l’attivazione è per via estrinseca le iniziatrici sono

casp8 e casp10; se l’attivazione è per via intrinseca la caspasi

iniziatrice è casp9). Attivate da stimoli extracellulari (casp-

→

8, casp-10). Rilascio del citocromo c (casp-9) Caspasi

Effettrici: clivano substrati proteici dando corso al processo

apoptotico (casp-3)

Via estrinseca

Sulla cellula vengono esposti i recettori di morte: FAS e

TNRF1. Il FASligando si lega a FAS che trimerizza portando

al reclutamento della proteina adattatrice FADD. Una volta

reclutata la FADD viene reclutata la pro-caspasi8. A questo

punto si forma il complesso DISC (complesso di segnale di

morte - death induced signaling complex), che permette

l’autoclivaggio di pro-casp-8 attivandola (casp-8)

Fas-FasL è coinvolto in diversi importanti fenomeni:

- eliminazione delle cellule infettate da virus

- eliminazione di linfociti autoreattivi

- eliminazione di linfociti nel controllo delle risposte immunitarie

Via intrinseca

Il “regista” di questa via è il mitocondrio, che riceve i

segnali. Regolata da proteine della famiglia Bcl,

questa famiglia contiene sia proteine anti- apoptotiche

che pro-apoptotiche:

- Anti-apoptotiche: Bcl-2, Bcl-x

- Pro-apoptotiche: Bax, Bak

All’interno di questa famiglia sono presenti anche

sensori del danno (Bim, Bid e Bad) che attivano Bax e

Bak.

Bax e Bak formano un poro (canale ad alta

permeabilità) sulla membrana mitocondriale esterna e

fuoriescono citocromo C ed altre proteine

Si forma l’apoptosoma e si attivano le caspasi

Proteine della famiglia Bcl-2

Le proteine che hanno 4 domini BH sono anti-apoptotiche. Le proteine che hanno 3 domini BH sono

pro-apoptotiche. Le BH3 only (che hanno 1 solo dominio BH) sono sensori del danno

Il link tra la via estrinseca e la via intrinseca è una proteina BH3 only: Bid

BCL-2 può essere inibito da Bid clivato

Bid clivato dalla caspasi 8 (della via estrinseca) si lega a Bcl-2 e libera Bax che oligomerizza e facilita

il rilascio del cit. c. Bid può essere clivato sia da Caspasi 8 che da Granzima (collegamento tra via

estrinseca e via intrinseca)

Formazione dell’apoptosoma

Quando il cit c si lega ad APAF-1, quest’ultimo cambia la sua struttura e vengono esposti dei domini

CARD, che si assemblano fra di loro e creano la struttura tridimensionale dell’apoptosoma.

→

L’assemblaggio di questa struttura determina la trasformazione della pro-casp 9 in casp-9 la casp-

La presenza della

9 taglia la pro-casp 3 in casp3. caspasi 3 clivata assicura che la cellula sta andando

incontro ad apoptosi.

Meccanismi di apoptosi

Fase finale

Taglio DNA da parte di endonucleasi Ca++/Mg++ dipendenti (multipli di ~ 200bp). Elettroforesi: se

cellula sta andando incontro a necrosi c’è uno smear perchè il DNA viene frammentato in punti non

specifici; se sta andando incontro ad apoptosi saranno frammenti di 200 bp

Esposizione di fosfatidilserina (segnale «eat-me» per fagociti), evidenziabile con annessina V

(questo fenomeno si chiama “flip-flop” delle membrane). I fagociti professionisti (macrofagi e

neutrofili) riconoscono la fosfatidilserina fagocitano i corpi apoptotici e rilasciano citochine anti-

infiammatorie. Questo fenomeno si può utilizzare in laboratorio per vedere per esempio una

→

determinata sostanza causa l’apoptosi coltivo le cellule, utilizzo la sostanza e poi utilizzo

→

l’annessina V legata a un fluoroforo se vedo fluorescenza l’annessina si è legata ai residui si

fosfatidilserina (è avvenuta apoptosi)

Punti chiave apoptosi

Patologie legate al malfunzionamento dell’apoptosi

Apoptosi inibita:

- Tumori (benigni e maligni)

- Malattie autoimmuni (mancato controllo dei linfociti autoreattivi)

- Infezioni virali (aumentata sopravvivenza delle cellule infette)

Apoptosi aumentata:

- AIDS (Linfociti TCD4)

- Disordini neurodegenerativi (M di Alzheimer, M di Parkinson)

- Sindromi mielodisplastiche (anemia plastica)

- Danno da ischemia (danno da riperfusione)

- Epatopatie da sostanze tossiche (es. alcool)

Necrosi - aspetti morfologici

Rigonfiamento della cellula, la cromatina si condensa, cariolisi e carioressi del nucleo, la membrana

→

perde di permeabilità e il contenuto intracellulare viene riversato all’esterno segnale di pericolo

→ attivazione dell’infiammazione

L’aspetto morfologico di necrosi si ha sia se è accidentale sia se è regolata. Nella stragrande

maggioranza dei casi la necrosi è regolata.

Aspetti morfologici:

- intensa eosinofilia della cellula morta, dovuta alla perdita di RNA e alla denaturazione delle

proteine

- i nuclei soggiacciono a picnosi, carioressi e cariolisi e scompaiono

- a causa della lesione di membrana, le proteine intracellulari (es. enzimi) possono essere

liberate dalle cellule morte ed essere rivelate nei fluidi extracellulari

- attivazione del processo infiammatorio da parte delle componenti cellulari rilasciate (DAMP:

Damage/Danger Associated Molecular Patterns) che vengono riconosciute da cellule di difesa

(cellule dendritiche, macrofagi,.....).

Sono osservazioni tardive non evidenziabili nelle prime fasi del processo necrotico (dove il fenomeno

è evidente solo a livello biochimico/molecolare)

Necrosi - due significati

1. Processi che portano a morte cellulare (es. “morte per necrosi”)

2. Le modificazioni che subisce il tessuto dopo la morte delle cellule se l’organismo resta vitale

→ diversi tipi di necrosi che dipendono dal destino delle proteine:

- Necrosi coagulativa (denaturazione massiva)

L’architettura del tessuto morto è mantenuta per qualche gg

→

Il danno denatura le proteine (anche le proteasi!) blocco della proteolisi

Le cellule necrotiche collassano per azione degli enzimi lisosomiali dell’infiltrato leucocitario

→

L’ischemia può causare necrosi coagulativa (tranne nel cervello) infarto

- Necrosi colliquativa →

Digestione delle cellule morte trasformazione del tessuto in liquido viscoso La struttura del tessuto

viene persa, infezioni microbiche, ischemia cerebrale

- Necrosi gangrenosa

È un termine usato nella pratica clinica, di solito riferito ad un arto che non riceve apporto di sangue

→

e va incontro a necrosi coagulativa. (in presenza di batteri si ha anche n. colliquativa gangrena

umida)

- Necrosi caseosa

Caratteristica di un focus infiammatorio detto granuloma. Es. nell’infezione tubercolare. Aspetto

bianco- friabile dell’area necrotica. L’area necrotica appare come un insieme di cellule lisate e residui

racchiusi entro un preciso limite infiammatorio

- Necrosi grassa

Aree focali di grasso lesionato dovuto al rilascio della lipasi pancreatica attivata all’interno del

→

pancreas o nella cavità peritoneale (pancreatite acuta) lisi delle cellule adipose del peritoneo

- Necrosi fibrinoide

Danno vascolare nelle reazioni immunitarie che coinvolgono i vasi sanguigni. Danno da

immunocomplessi (ipersensibilità di terzo tipo). Aspetto fibrinoide.

Key points →

- Danno cellulare irreversibile necrosi

- Sempre associata alla distruzione delle membrane cellulari

→

- Fuoriuscita di enzimi e altre componenti (DAMPS) INFIAMMAZIONE

Caratteristica delle cellule:

- Eosinofilia - Frammentazione e dissoluzione

- Rottura membrane plasmatiche e - Fuoriuscita e digestione enzimatica dei

organelli contenuti intracellulari

- Restringimento del nucleo

Necrosi regolata (necroptosi)

Può partire da un segnale esterno:

- danno al DNA da agenti alchilanti

- eccitotossine →

- legame con il recettore della morte TNF può

innescare una necrosi regolata oltre all’apoptosi per

via estrinseca →

Viene bloccata la via dell’apoptosi proteine RIPK vengono

→ →

fosforilate fosforilazione delle proteine MLKL creano

dei pori sulla membrana plasmatica

- Innescata da specifici recettori di morte (FAS, TNFR1,

TLR3,TLR4)

- Si manifesta morfologicamente con un aspetto

necrotico

- Coinvolta in processi patologici (infezioni virali, es. citomegalovirus, pancreatiti, ischemia)

ma anche fisiologici (omeostasi dei cellule T, placca di accrescimento ossa lunghe)

→ →

- Dipende dall’attivazione di RIPK3 fosforilazione di MLKL rottura della membrana

- Caspasi-indipendente

- Stimola la risposta infiammatoria come la necrosi

Morte cellulare regolata: mille e uno modi di morire...

- 1972: scoperta apoptosi - 2007: entosi

- 1994: anoikis - 2012: ferroptosi

- 2001: piropoptosi - 2013: autosi

- 2005: necropoptosi - Ecc

Anoikis: “senza casa”

Indotta dal distacco di cellule dalla matrice extracellulare (ECM), caratterizzata da:

- Mancanza di trasduzione della β-1 integrina

- Down-regolazione di EGFR (epidermal growth factor receptor)

- Inibizione del signaling di ERK1 (extracellular-regulated kinase 1)

- Overespressione di BIM (pro-apototico che favorisce l’attivazione di BAK-BAX), membro

della famiglia BCL-2

Nella maggior parte dei casi la morte sopraggiunge attraverso i meccanismi molecolari dell’ apoptosi

intrinseca.

Non tutte le cellule sono soggette a morte per anoikis, per esempio un leucocita che è una cellula

circolante non muore per anoikis.

La resistenza all’anoikis è particolarmente rilevante nelle cellule tumorali, per l’implicazione nei

processi metastatici (una cellula epiteliale non dovrebbe potersi staccare dal suo tessuto e

sopravvivere)

Morte per autofagia

È mediata dall'attivazione dei meccanismi molecolari dell'autofagia. È inibita dall'inibizione del

pathway autofagico:

- Agenti chimici (contro VPS34)

- Manipolazione genetica ( k.o./ mutazioni o RNAi contro modulato