Appunti di Microbiologia con Laboratorio - Lezione 3

Terreni di coltura

I terreni di coltura sono soluzioni utilizzate per la crescita dei microrganismi. Nella lezione

precedente abbiamo parlato dei metodi di sterilizzazione e abbiamo visto come le soluzioni dei

terreni di coltura possano essere sterilizzate mediante uso di autoclave (sterilizzazione calore

umido).

Esistono terreni minimi o massimi, a seconda che sia nota o sconosciuta la composizione chimica.

Il pregio dei terreni massimi consiste nel fatto che sono molto ricchi (i batteri ci crescono molto

bene e anche in modo vigoroso), ma abbiamo difficoltà nel poter indagare sui processi metabolici.

Sui terreni minimi possiamo invece giostrare la composizione e osservare che forza ha ogni singola

componente sulla crescita. Abbiamo visto anche che possono essere sia terreni solidi che terreni

liquidi, a seconda che ci sia o no l’agar.

Terreni differenziali

È un terreno di coltura che consente la crescita di diversi microrganismi e di discriminare questi

microrganismi in base alla loro attività metabolica. Siamo in grado di differenziare i microrganismi

grazie al terreno che mette in evidenza le loro caratteristiche metaboliche.

Sono proposti due esempi, uno che ha un forte interesse applicativo e l’altro prettamente di ricerca.

• Il primo esempio serve per individuare microrganismi produttori di esoproteasi, quindi

microrganismi capaci di secernere nel mezzo esterno enzimi proteolitici: il terreno ha le

caratteristiche che abbiamo descritto ieri, ma a cui si aggiunge una proteina come

l’albumina (nella maggior parte dei casi si usa questa, in quanto è disponibile di solito in

quantità sufficienti e a costi contenuti). Quando sterilizziamo in autoclave (a 120°C) le

proteine si denaturano: una soluzione che è limpida (perché l’albumina va in soluzione)

diventa opalescente a causa della denaturazione di questa proteina. Abbiamo un terreno

solido (attenzione: questi terreni sono tutti i terreni solidi!) opalescente per la presenza della

proteina denaturata al suo interno. Piastriamo il nostro campione di microrganismi che

vogliamo caratterizzare, e questi crescono formando varie colonie: abbiamo visto ieri che, se

poggiamo una cellula su un terreno solido, questa si accresce formando un agglomerato

visibile ad occhio nudo che chiamiamo colonia. Se le cellule presenti all’interno di una di

queste colonie sono capaci di produrre un enzima proteolitico, di secernere un’esoproteasi,

degraderanno l’albumina e creeranno un alone chiaro intorno alla propria colonia (in quanto

hanno degradato una proteina). Avrete quindi sul terreno colonie che sono cresciute su

questo terreno opalescente ed è rimasto opalescente attorno alla colonia, e altre colonie che

sono circondate da un alone trasparente. Quest’ultime sono formate da microrganismi

produttori di esoproteasi. Questo è un test che ha un interesse applicativo in quanto, se ne

avremo occasione, molto più avanti, vedremo brevemente alcuni aspetti industriali; e uno

degli enzimi che vengono purificati da colture batteriche sono appunto gli enzimi

proteolitici. L’industria ha bisogno della proteasi in quantità enormi (tonnellate annue) in

quanto sono presenti in molti composti come i detersivi che usiamo per lavare (sono tutti

addizionati di enzimi proteolitici). Più è semplice la produzione di questi enzimi, più

economico diventa il processo e, quindi, se ne può usare in grande quantità.

• Un altro terreno che viene utilizzato prevalentemente in laboratorio è un terreno che viene

usato per evidenziare la capacità di E. coli di idrolizzare uno zucchero come lattosio. Come

sappiamo, eosina-blu di metilene è un indicatore di pH che cambia colore in base al pH del

terreno. Le cellule capaci di idrolizzare il lattosio nel processo di degradazione dello

zucchero portano alla produzione di acido piruvico, il quale acidifica il terreno e fa virare le

colonie a un colore sul rosso vinaccia. Al contrario, se non sono capaci di idrolizzare questo

zucchero, le colonie restano bianche. Come sappiamo da Genetica, l’utilizzo del lattosio è

molto sfruttato per studiare la regolazione dell’espressione genica in E. coli (ha trovato

ampie applicazioni in questo sistema ma anche in altri meccanismi).

I terreni differenziali hanno quindi la caratteristica di consentire la crescita di diversi microrganismi

e specie diverse e di mettere in evidenza la diversità metabolica tra loro.

Terreni selettivi

I terreni selettivi sono capaci di far crescere un solo tipo di microrganismo.

Facciamo dei semplici esempi di terreno selettivo, che possiamo immaginare abbastanza facilmente:

• Se non mettiamo azoto nel terreno, gli unici microrganismi che potranno crescere sul terreno

solo gli azoto fissatori, microrganismi capaci di fissare l’azoto atmosferico.

• Su un terreno con antibiotico cresceranno solo microrganismi resistenti a quest’antibiotico.

Non esiste un terreno di coltura universale su cui cresce qualunque tipo di microrganismo e, di per

se stesso, qualunque terreno di coltura è un terreno selettivo (obbligatoriamente). Ci riferiamo,

però, a terreni selettivi quando noi sfruttiamo volutamente dei terreni per selezionare un determinato

microrganismo, terreni su cui cresce qualcosa che abbiamo definito in modo preciso.

Il fatto che non ci sia un terreno di coltura universale è un aspetto molto importante che dovremo

riprendere più avanti, in quanto influisce notevolmente sulle nostre conoscenze del mondo

microbico. Vedremo poi perché, quindi teniamolo presente.

Quando facciamo una crescita su terreno

solido si formano colonie (agglomerati di

cellule tutte uguali). Ogni specie batterica

ha una sua caratteristica di crescita, di

formazione di colonie su terreno solido.

Su questa diapositiva vedete raffigurate

alcune morfologie più comuni a livello

delle colonie batteriche: possiamo

osservare la forma, lo spessore della

colonia o, con un leggero ingrandimento,

il bordo della colonia stessa. Se si

osserva, vi è una forte varietà.

La morfologia di colonia è abbastanza

tipica di ogni specie batterica ma, prima di utilizzarla per identificare un microrganismo, dobbiamo

tenere presente che è altamente influenzata dalle condizioni di crescita (cosa c’è nel terreno, la

temperatura, vari aspetti): ci può quindi dare qualche indicazione ma con cautela, in quanto non è

un parametro fisso e può variare a seconda delle condizioni ambientali.

Osserviamo qui tre esempi di colonie.

A sinistra abbiamo un campione, molto

probabilmente ambientale, piastrano su

un terreno di coltura in cui sono

comparse le colonie. L’altra

caratteristica, come è possibile vedere,

consiste che queste colonie sono colorate

e ciò non sorprende: a seconda dei terreni dei terreni che utilizziamo e della provenienza dei

campioni, le cellule possono produrre pigmenti → è per questo che possiamo avere colonie rosse,

gialli, verdi. Certe volte, come vedremo, rilasciano il pigmento nel terreno e il terreno stesso diviene

colorato. Inoltre, utilizzando terreni adatti alle specie batteriche, osserviamo delle morfologie molto

belle, che assomigliano quasi a dei quadri: sono crescite su terreno solido operate da microrganismi.

Abbiamo sia la varietà che, allo stesso tempo, forme peculiari.

Osservazione al microscopio

Per osservare le cellule batteriche occorre un sistema

d’ingrandimento: il microscopio.

A fianco è mostrata la fotografia di un microscopio ottico

comune, già visto in laboratorio e in vari filmati.

Il problema, quando noi osserviamo direttamente una

cellula batterica presente in un campione con un

microscopio ottico, è che si vede male: ciò è dovuto al

poco contrasto tra la cellula e il mezzo in cui questa è

immersa, in quanto le cellule sono piccole, sottili e quindi

sono quasi praticamente trasparenti. Se quindi noi

vogliamo utilizzare un microscopio ottico per osservare

direttamente le cellule presenti in un campione, dobbiamo

ricorrere a un microscopio con un’ottica particolare,

quella che si chiama contrasto di fase.

Perché quando noi facciamo un’osservazione diretta al microscopio non riusciamo a discriminare

tra la cellula batterica e il mezzo? Questo è dovuto al contrasto.

Come possiamo osservare, il raggio luminoso che attraversa la cellula batterica e il raggio luminoso

che attraversa il mezzo in cui è immersa la cellula batterica arrivano all’ottica del microscopio in

maniera leggermente sfalsata (se non

facciamo nulla). Questa leggerissima

sfasatura non è sufficiente a dare un

contrasto netto facilmente visibile.

Questi microscopi a contrasto di fase hanno

un sistema che riesce ad accentuare la

differenza di fase tra questi due raggi

luminosi. A questo punto, quando

osserviamo il campione all’oculare, vi è un

forte contrasto tra la luce che ha attraversato

il campione e la luce che ha attraversato il

mezzo.

A fianco possiamo osservare le immagini di cellule

abbastanza grosse e facilmente visibili. A sinistra

abbiamo un’immagine presa a campo chiaro, ossia senza

nessun accorgimento. A destra abbiamo ciò che vediamo

se inseriamo un contrasto di fase.

Questo è un esempio per mostrare la forte differenza tra

queste due immagini; ma, essendo queste cellule

abbastanza grandi, riusciamo già a intravedere qualcosa in

campo chiaro. Tuttav