Appunti di Microbiologia

Microbiologia - 6 CFU - Prof Prosseda

Appelli

Esame: fine corso a metà novembre. Esonero risposta chiusa (gennaio) più colloquio orale oppure orale classico. Esonero: 30 domande in 25 minuti.

Esercitazioni: Testi consigliati

• Laboratori didattici (12 ore) dopo la metà di novembre di Gianni Dehò e Enrica Galli, "Biologia dei microrganismi", seconda edizione
• Madigan M.T. and Martinko J.M.: Brock, Biologia dei microorganismi.
• Terreni di coltura e preparazione delle piastre
• Le culture e la conta batterica: le diluzioni.
• Il test di Gram: la colorazione differenziale e l’analisi al microscopio ottico.
• L’antibiogramma: analisi della sensibilità e resistenza dei batteri agli antibiotici.
• Il test di Ames: risposta dei batteri alle radiazioni UV.
• Metodi di diagnosi in virologia e metodi di titolazione di preparazioni virali
• La lisi fagica e analisi delle placche di lisi: determinazione del titolo fagico

Programma di microbiologia (52 ore)

1. Struttura e funzione della cellula procariotica (20 ore)

Scoperta del mondo microbico: principali esperimenti storici. La diversità ed evoluzione nei microrganismi. Struttura, funzione e biosintesi della parete cellulare dei batteri e negli Archea. I sistemi di esportazione e di secrezione. Gli organelli citoplasmatici. Struttura e funzione della membrana citoplasmatica. Biosintesi e funzione del flagello e dei pili. La divisione cellulare e la sporulazione. Sistemi di regolazione nei batteri. Terreni di coltura e la crescita nei batteri.

2. Il genoma batterico, plasticità ed evoluzione (10 ore)

Organizzazione del cromosoma batterico: il nucleoide. I plasmidi: struttura, funzione e meccanismi di replicazione. Gli elementi trasponibili. Gli integroni. Meccanismi di trasferimento genico orizzontale. Formazione dei ceppi Hfr. La coniugazione. La trasformazione.

3. Interazione dei microrganismi con gli ambienti biotici e abiotici (10 ore)

Concetto di microbiota e di microbioma. Meccanismo d’azione delle esotossine. Fattori di virulenza e sistemi di difesa naturali. Il quorum sensing e la formazione dei biofilm. Le principali classi di antibiotici, meccanismi di azione e insorgenza della resistenza. I sistemi di trasduzione del segnale: dalla sintesi delle porine alla chemiotassi. L’interazione dei microrganismi con gli organismi eucariotici: dalla simbiosi alla virulenza. Adattamento genico alle risposte degli ospiti. Cenni di immunità innata.

Introduzione

La microbiologia è la scienza che studia i microrganismi e la loro attività. Tra i microrganismi troviamo virus, batteri, funghi, protozoi e alcune alghe. Tutti questi sono esseri viventi, eccetto i virus che non hanno un'organizzazione cellulare e non hanno un proprio metabolismo. La microbiologia si occupa quindi di tutti gli organismi non visibili a occhio nudo, di dimensioni variabili tra 1 µm (dimensione della maggior parte dei batteri) e 10 nm. Questi organismi possono essere osservati solo attraverso i microscopi, di cui ne esistono vari tipi:

• Microscopio ottico
• Microscopio elettronico (SEM o TEM)

Generazione spontanea

Per anni è stata preponderante la teoria della generazione spontanea, secondo la quale organismi possono nascere “dal nulla”; l’esperimento di Redi dimostrò la falsità della generazione spontanea attraverso l’osservazione della carne che va a male. Lasciando la carne a contatto con l’aria, questa forma larve di mosca; se invece il contenitore è chiuso, la carne va comunque a male ma non forma larve. Per cui le larve sono portate dal contatto con l’ambiente esterno.

Successivamente Needham e Spallanzani fecero un altro esperimento: Needham mise a bollire un brodo in modo da uccidere eventuali microrganismi al suo interno, ma lasciando il contenitore aperto questi si riformarono o venivano trasportati dall’esterno. Spallanzani invece chiuse il contenitore e osservò che in questo caso il brodo non veniva contaminato.

La prova definitiva della falsità della generazione spontanea arriva con Pasteur; fa un esperimento simile a quello di Spallanzani ma utilizza un contenitore con collo a S in modo che la polvere non possa raggiungere il liquido. In questo modo si dimostra anche che la polvere porta con sé i microrganismi.

Terreni di coltura

Robert Koch mise a punto terreni di coltura solida per far crescere i batteri in singole colonie utilizzando della gelatina. Successivamente Hesse, uno studente di Koch, utilizzò l'agar agar, migliore in quanto alcuni microrganismi prendono la CO₂ dalla gelatina, degradandola. Petri mise a punto una capsula tuttora usata per la coltura di microrganismi.

Classificazione

La classificazione dei batteri è difficile in quanto il concetto di specie nei microrganismi è abbastanza vago perché presuppone riproduzione sessuale. La classificazione odierna (di Woose) prevede tre domini:

• Batteri
• Archea: contemporanei ai batteri ma presentano caratteristiche considerate più antiche
• Eucarioti (anche alcuni eucarioti fanno parte dei microrganismi)

Numeri

I procarioti comprendono circa 7000 specie (insetti 900.000) ma è probabilmente solo l’1% di tutte quelle realmente esistenti. Considerando invece i numeri di individui sulla Terra ci sono circa 5x10³⁰ cellule batteriche e si distribuiscono ovunque sulla Terra, all’interno di essa e all'interno di ogni organismo (simbionti) grazie alla loro grande capacità di adattamento (iceberg, laghi salati, sorgenti sottomarine…)

Dimensioni

I batteri possono avere dimensioni variabili, la maggior parte hanno dimensioni di circa 1 µm ma ci possono essere alcuni esempi di batteri fuori range:

• Epulonipiscium fishelsoni con dimensioni 200-700 µm grazie alla presenza di sacche d’aria (come la vescica gassosa dei pesci)
• Thiomargarita con dimensioni di 10-20 mm grazie alla presenza di sacche di accumulo di alcuni elementi

Generalmente gli organismi tendono a essere piccoli per il rapporto S/V, che tende a essere a favore della superficie. Ma aumentando il volume, il rapporto diminuisce e per questo motivo le cellule tendono a essere piccole. Le cellule superiori sono invece più grandi in quanto riescono a concentrare la diffusione dei nutrienti grazie alla presenza di compartimenti interni.

Riguardo invece batteri più piccoli del normale, il più piccolo che è stato scoperto è 1/10 di E. Coli. Esistono delle dimensioni minime perché DNA, RNA… devono avere un minimo di spazio all'interno del quale muoversi. Nel caso di questo batterio invece, che è un patogeno intracellulare obbligato, questo prende a.a. e tutto ciò che gli serve dalla cellula dell’ospite e ha quindi potuto eliminare, evolutivamente, la parte metabolica legata agli a.a., alle vitamine… conservando solo l’essenziale.

Morfologia

I batteri vengono suddivisi in base alla loro forma:

• Cocchi: hanno forma sferica e possono unirsi tra loro formando diplococchi, streptococchi, stafilococchi…
• Bacilli a forma di bastoncelli
• Vibrione
• Spirillo

La diversa morfologia dei batteri è determinata dal citoscheletro, meno complesso rispetto a quello delle cellule eucariotiche, ma comunque presente. Tra i componenti fondamentali troviamo:

• MreB è un filament che forma un elicoide che si appoggia sulla membrana cellulare interna
• FtsZ forma un anello che fa replicare l'organismo

Struttura delle cellule procariotiche

I batteri si dividono in Gram positivi e Gram negativi in base alla colorazione di Gram e in particolare in base a una particolare struttura della parete cellulare. La parete cellulare può anche essere chiamata peptidoglicano o mureina.

Gram negativi o didermi

Questo tipo di batteri hanno la membrana interna, una parete cellulare abbastanza sottile e un’ulteriore membrana esterna. Si forma quindi uno spazio tra le due membrane, che contiene la parete e che prende il nome di spazio periplasmatico. Nello spazio periplasmatico avvengono tutte le reazioni principali che non potrebbero avvenire all’interno del batterio, e che nelle cellule eucariotiche avvengono in organelli specifici, come lisosomi o perossisomi.

Gram positivi o monodermi

Questo tipo di batteri hanno la membrana interna e una parete cellulare molto più spessa rispetto a quella dei Gram negativi. In questo caso non è presente lo spazio periplasmatico, ma le reazioni avvengono comunque in quello spazio, delimitato nei Gram positivi da membrana interna e parete. Dal punto di vista evolutivo si potrebbe pensare che si siano evoluti prima i monodermi e poi sia stata apposta un’ulteriore membrana per protezione. Recenti studi dimostrano però che i didermi si sono evoluti prima e i monodermi si sono evoluti dai didermi per perdita della membrana esterna.

Test di Gram

• Strisciare i batteri su un vetrino da microscopio
• Fissare sul vetrino: si scaldano i batteri, uccidendoli. Questa operazione fa rimanere integri gli organismi

Cristalvioletto: questo colorante penetra all’interno di tutti i batteri colorando le componenti acide della parete batterica.

Iodio: rende impermeabili le membrane.

Alcol etilico: la colorazione dei Gram negativi verrà lavata via, dato che hanno una parete sottile mentre i Gram positivi resteranno colorati di viola.

Safranina: questo colorante rende le cellule rossicce, rendendo visibili i batteri Gram negativi, mentre non riesce ad entrare nei Gram positivi dato che hanno una parete spessa.

Membrana cellulare

La membrana plasmatica delle cellule batteriche ha la stessa organizzazione generale di una qualsiasi cellula:

• Membrana formata da un doppio strato fosfolipidico
• Proteine che possono essere associate alla membrana in vari modi
• Non è presente il colesterolo ma ci sono degli opanoidi; questi hanno una struttura chimica simile al colesterolo e hanno quindi la stessa funzione nella fluidità della membrana
• Movimenti incessanti della membrana e dei fosfolipidi (rotazione, flessione, flip-flop…)
• Tra i fosfolipidi più abbondanti troviamo fosfatidil-etanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilcolina, sfingomielina. Un altro fosfolipide molto abbondante (20%) è la cardiolipina, che è molto abbondante anche nella membrana mitocondriale interna, a supporto della teoria endosimbiontica.

Membrana degli Archea

Negli Archea le molecole presenti all’interno della membrana sono chimicamente molto simili ai fosfolipidi, ma hanno degli aspetti diversi:

• Catene isopreniche e non acidi grassi come coda. Dal punto di vista chimico non cambia molto, dato che la catena isoprenica è idrofobica come gli acidi grassi
• Legame etere tra catena isoprenica e glicerolo e non estere
• Glicerolo in forma L e non D
• Bifitanile invece dei fosfolipidi nel caso di batteri ipertermofili (adattati a temperature di 80-90°C). Questa molecola è meno flessibile e quindi garantisce che la membrana non sia troppo fluida. La catena di bifitamile può essere interrotta da opanoidi che aumentano la fluidità della membrana nel caso di batteri che si siano adattati a vivere a temperature più basse.

Funzioni

• Barriera semipermeabile. Il trasporto può essere di vari tipi:
• Diffusione semplice: secondo gradiente e senza utilizzo di energia
• Diffusione facilitata
• Trasporto attivo: contro gradiente di concentrazione e può avvenire tramite uniporto, simporto e antiporto

Per capire il tipo di trasporto attraverso il quale le sostanze possono fluire attraverso la membrana si può fare un’analisi aumentando gradualmente le concentrazioni. Se l’incremento è graduale e costante la diffusione è semplice, quindi senza utilizzo di trasportatori specifici. Se invece l’incremento è prima esponenziale e poi arriva a una fase stazionaria il trasporto avviene grazie a dei trasportatori, che vengono saturati. Generalmente i trasportatori sono definiti ABC (ATP-binding cassette e sono proteine con 12 domini alfa-elica).

• Ancoraggio di proteine
• Conservazione dell'energia
• Gradiente protonico transmembrana che si crea grazie ad una diversa distribuzione di ioni (gradiente ionico) e di cariche (gradiente elettrico). Si crea quindi un gradiente elettrochimico che può essere utilizzato per creare energia, secondo la teoria chemiosmotica.

Parete batterica (peptidoglicano o mureina)

La parete batterica è importante conoscerla, in quanto la maggior parte degli antibiotici utilizza come target principale proprio la parete, in quanto è esclusiva dei batteri. La parete batterica è chimicamente diversa da quella delle cellule vegetali ed è composta da un sacculo di mureina, ovvero un’unica struttura polimerica che avvolge completamente la cellula formando un esoscheletro cellulare.

Funzioni

• Contribuisce alla forma della cellula e ne fornisce il supporto strutturale.
• Resiste ai danni dovuti alla pressione osmotica: se si mette una cellula batterica in una soluzione ipotonica, questa tende a gonfiarsi ma il peptidoglicano non fa lisare la cellula.
• Fornisce un certo grado di resistenza alla diffusione delle molecole (effetto setaccio).
• È una molecola singola, simile a un sacco, senza soluzione di continuità.

Il peptidoglicano è composto da catene di polisaccaridi, formati da due amminozuccheri alternati:

• N-acetil-glucosamina (NAG)
• N-acetil-muramico (NAM)

NAM e NAG si legano tra loro attraverso legami covalenti β-1,4 (trans) e al NAM si lega un tetrapeptide tramite il quale le catene glicaniche si legano tra loro, tramite un legame tra il terzo residuo di una catena e il quarto residuo dell’altra.

Gram negativi

Generalmente gli a.a. caratteristici dei Gram - sono:

• L-alanina
• Acido D-glutamico
• Acido meso-diaminopimelico
• D-alanina

Gram positivi

I Gram + differiscono dai Gram - per il tipo di a.a. del polipeptide:

• L-alanina
• Acido D-iso glutamico
• L-lisina
• D-alanina
• D-alanina

Inoltre nei Gram + il legame peptidico è mediato da un ponte di 5 glicine e nella parete sono presenti dei polimeri di acido teicoico che ha le seguenti funzioni:

• Influenza le caratteristiche chimico-fisiche della parete cellulare (porosità, elasticità, resistenza, ecc.)
• Controlla l'acquisizione di cationi (ad es. Ca²⁺, Mg²⁺)
• È coinvolto nell’immagazzinamento di fosfati
• Ancorano gli strati di peptidoglicano alla membrana citoplasmatica

Parete degli Archea

Negli Archea il peptidoglicano è funzionalmente simile ma ci sono alcune differenze chimiche, e per questo motivo viene definito pseudopeptidoglicano:

• Il legame è β-1-3, e quindi insensibile al lisozima
• Non c’è il NAM, che è sostituito dal NAT (acido N-acetiltalosaminuronico)
• Amminoacidi tutti in conformazione L
• Peptidi di diversa misura

Biosintesi

La biosintesi del peptidoglicano è un processo complesso che avviene in tre tappe, ognuna delle quali avviene in un compartimento diverso.

I fase - citoplasma

La prima molecola ad essere prodotta è l’UDP-NAG, precursore sia del NAG che del NAM, a partire dal fruttosio-6-fosfato e dall’UTP. Affinché avvenga questa reazione è necessaria la presenza degli enzimi GlmS, GlmM e GlmU. Successivamente, al gruppo ossidrile in posizione 3’ dell’UDP-NAG può essere trasferita una molecola di fosfoenolpiruvato (PEP) ad opera dell’enzima MurA per formare un intermedio che viene successivamente trasformato in UDP-NAM da MurB.

Per quanto riguarda la componente peptidica, essa viene sintetizzata sotto forma di pentapeptide nel quale, gli L-amminoacidi compreso il DAP, derivano dalle normali vie metaboliche mentre i D-amminoacidi necessitano di enzimi biosintetici specifici per la loro forma D. Gli enzimi responsabili della sintesi del pentapeptide legato al NAM sono noti come ligasi Mur. Essi provvedono a catalizzare il legame dell’alanina al residuo carbossilico dell’UDP-NAM e, in successione, all’aggiunta dell’acido D-glutamico e dell’acido meso-diaminopimelico o lisina, mentre gli ultimi due amminoacidi vengono aggiunti sotto forma di dipeptide, costituito nella maggior parte dei casi dal dimero D-ala-D-ala.

II fase - membrana plasmatica

Poiché l’assemblaggio del peptidoglicano avviene nel periplasma, vi deve essere un qualche meccanismo che permette ai precursori sintetizzati nel citoplasma di oltrepassare la membrana citoplasmatica. Tale meccanismo è permesso dal trasportatore lipidico bactoprenolo, un alcol altamente idrofobico composto da 55 atomi di carbonio.

Ad esso si lega dapprima l’UDP-NAM-pentapeptide, formando il cosiddetto lipide I, e solo successivamente l’UDP-NAG, originando il lipide II. A questo punto, il bactoprenolo legato al monomero di glicano, si ribalta sulla faccia periplasmatica della membrana dove gli enzimi transglicosilasi promuovono la formazione dei legami glicosidici tra il monomero ed il filamento di glicano.