Appunti di Genetica

LEZIONE 1→ciclo cellulare, mitosi e meiosi (a grandi linee)

La cellula umana deve replicare e segregare correttamente un grande numero di nucleotidi

alla sue cellule figlie. La molecola di DNA è molto stabile ma può essere danneggiata, infatti

subisce delle lesioni ogni giorno (rottura di una delle 2 eliche o entrambi, alchilazioni,

depurinazioni, lesioni ossidative e danni da luce solare, ovvero creazione di dimeri di

pirimidina). La cellula ha svariati meccanismi per la riparazione dei danni al DNA, ma se non

vengono riparati, vengono trasformati in mutazioni che saranno trasmesse in eredità.

Es: Xeroderma Pigmentoso (XP): mutazione del NER: sistema che ripara i danni causati dai

raggi ultravioletti; questa determina un rischio 1000 volte superiore di sviluppare tumori alla

pelle. I raggi ultravioletti causano sempre le stesse lesioni (dimero di pirimidina) a tutti gli

individui ma i pazienti XP non sono in grado di ripararli. La loro pelle sviluppa moltissime

mutazioni, che potrebbero anche consistere nell'attivazione di un oncogene o disattivazione

di un oncosoppressore (il loro genoma è quindi instabile).

La mutazione non è sempre una cosa negativa perché causa la variabilità genetica, che è

la forza di una popolazione. Oppure torna utile per scopi commerciali (es: banana triploide,

sterile, commestibile perché non ha semi, a differenza di quella diploide che sarebbe

immangiabile). Il problema è che la pianta di banana essendo sterile non è creata

dall’incrocio di semi, di conseguenza si generano piante geneticamente identiche, il che le

rende tutte sensibili all'attacco di funghi e malattie.

CONCETTI DI BASE DA SAPERE

-​ livelli di organizzazione / condensazione del DNA (istoni, nucleosoma…)

-​ il genoma è la totalità del materiale

genetico ed è composto da una parte

che viene tradotta e una che non viene

tradotta. Il genoma di un organismo fa

riferimento al DNA contenuto nel nucleo

e non a quello contenuto negli organelli

-​ C= corredo cromosomico aploide

2C= corredo cromosomico diploide

-​ con l’incremento della complessità

dell’organismo cambia la densità

genica: inferiore negli eucarioti piuttosto

che nei procarioti (diminuisce

all'aumentare della complessità, infatti

più un organismo è complesso,

maggiore è la proporzione del suo DNA

non codificante)

-​ Ciclo e fasi cellulari (eucariotiche)

-​ Fasi della mitosi

-​ Fasi della meiosi

La ricombinazione in meiosi serve per la variabilità genetica. Lo scopo del crossing over è

assicurare e mantenere l'appaiamento degli omologhi e permettere la corretta segregazione

di essi.

LEZIONE 2→Struttura e replicazione del DNA

Cromosoma dopo replicazione (completamente condensato) con →

2 cromatidi fratelli.

Il DNA è formato da una struttura base ripetuta, il nucleotide,

composta da: zucchero (desossiribosio), base azotata (purinica cioè

A e G o pirimidinica, cioè T e C) e almeno un gruppo fosfato. Il DNA

ha polarità: cioè 2 diverse estremità, denominate 5’ e 3’.

All’inizio del ‘900 Chargaff ha determinato la percentuale delle

diverse basi nella molecola di DNA, riscontrando una

somiglianza tra tutti gli organismi, dal quale enunciò la regola di

somiglianza di composizione delle basi: la percentuale di A è

simile a quella di T e quella di C a G. Questa osservazione ha

contribuito alla definizione della struttura a doppia elica della

molecola di DNA, che è stata ottenuta da 4 ricercatori: Rosalind

Franklin, Maurice Wilkins, Francis Crick e James Watson.

Hanno effettuato degli studi sulla diffrazione dei raggi X, cioè

hanno bombardato la molecola di DNA con un fascio di questi

raggi, per determinare la struttura tridimensionale e

l'organizzazione spaziale della molecola. Ottennero delle

immagini di diffrazione che vennero registrate su una pellicola

fotografica e arrivarono alla conclusione che il DNA possedesse una struttura elicoidale,

caratterizzata da 2 periodicità (una di 3,4 Å e una di 34 Å).

Il numero di legami tra le basi non è uguale: tra T e A ne esistono 2, mentre tra G e C ne

esistono 3. Questi legami essendo abbastanza deboli si possono rompere, permettendo ai 2

filamenti della doppia elica di distaccarsi e quindi aprire la molecola al bisogno (es:

replicazione).

Replicazione del DNA avviene in fase S, una sola volta ad ogni ciclo cellulare.

Il ciclo parte dalla fase G1 in cui si ha la crescita della cellula, seguita dalla fase S, durante

la quale il corredo genetico, composto da 46 cromosomi, viene replicato mediante la

replicazione del DNA. Dopo inizia la fase G2, in cui la cellula si prepara ad eseguire la

mitosi, ovvero la generazione delle cellule figlie, in cui si ha la segregazione dei cromatidi

fratelli che si dispongono sulla piastra metafasica.

L’enzima deputato alla replicazione del DNA è la

DNA polimerasi, che ha una forma riconducibile

a quella di una mano: nell'incavo si ha l'ingresso

dei nucleotidi che vengono aggiunti all'estremità

libera del DNA. L’enzima è composto da diverse

subunità accessorie, ma quella fondamentalmente

per il processo osservato è la catalitica.

Esistono vari tipi di DNA polimerasi: quella che

opera nell’essere umano è la DNA polimerasi III,

ma negli eucarioti vi sono più tipi coinvolti,

numerati con le lettere greche (Ⲁ, , ε,…), per via della necessità di maggior

specializzazione. La polimerasi III è presente anche nell’organismo E. coli, insieme alla DNA

polimerasi I (chiamata così poiché fu la prima ad essere isolata e purificata biochimicamente

in vitro), che è però coinvolta nel processo di riparazione del DNA.

Schema del meccanismo di sintesi del DNA È necessario un

filamento stampo di

DNA, che funzioni da

innesco, cioè

un'estremità 5’ -OH su

cui la polimerasi agisca,

infatti questa lavora

sempre in direzione

5’→3’. L’enzima va a

catalizzare l’aggiunta

del nucleotide

rispettando la

complementarità delle

basi, con la formazione

del legame

fosfodiesterico, che libera pirofosfato. Però, le DNA polimerasi non sono capaci di partire da

zero ad inserire nucleotidi dal filamento stampo. La replicazione del DNA, quindi, oltre alla

DNA polimerasi necessita anche di un enzima chiamato DNA primasi che fornisce l'innesco

(primer), cioè un primo corto pezzo di RNA (da 15 a 30 ribonucleotidi) e che costituisce

l'estremità da qui partirà l’allungamento. Sia procarioti che eucarioti hanno un'unica DNA

primasi. La DNA polimerasi allunga poi l’innesco.

Ⲁ

Durante gli anni in cui venne studiata la replicazione del DNA furono inizialmente ipotizzati 3

possibili metodi in cui avviene la replicazione:

-​ modalità semiconservativa

-​ conservativa

-​ dispersiva

1. Nell’ipotesi semiconservativa, la doppia elica di DNA presente nella cellula si apre e viene

sintetizzata un'elica di neo-sintesi a partire da ciascuno dei 2 singoli filamenti. Per cui ogni

nuova molecola di DNA risulta essere costituita da un filamento preesistente (stampo) e uno

di nuova sintesi. L'elica parentale, quindi, è conservata per metà.

2. L’ipotesi conservativa consiste nel fatto che la molecola di DNA stampo rimanga come

tale e per qualche processo non identificato, si generi un’altra molecola in cui entrambe le

eliche siano di nuova sintesi. La doppia elica parentale è, quindi, completamente conservata

nella prima.

3. Nella modalità di replicazione dispersiva vi è un mix, cioè si generano molecole di DNA di

nuova sintesi in cui sono presenti porzioni dell’elica parentale.

Queste ipotesi vennero testate sperimentalmente, mediante l'utilizzo di nucleotidi marcati

con isotopi pesanti, e si è dimostrato che quella che avviene realmente nelle cellule è una

replicazione di tipo semiconservativo; quindi, le restanti ipotesi vennero scartate.

Quindi quando il doppio filamento si apre, la DNA polimerasi si attacca a ciascuno di essi ed

inizia il suo lavoro ma, in uno dei 2, dovrebbe procedere in senso opposto, poiché questi

hanno polarità opposte. Invece siccome l’enzima lavora sempre in 5’→3’, in un filamento

comincerà a inserire i nucleotidi in modo discontinuo, ovvero mediante brevi frammenti,

chiamati frammenti di Okazaki (dal nome dello studioso che li ha identificati), generati e poi

rilegati insieme da uno specifico enzima. L’elica sintetizzata continuativamente viene

chiamata “leading strand”, mentre l'elica replicata in modo discontinuo è chiamata “lagging

strand”. I frammenti di Okazaki vengono per lo più generati attraverso la DNA polimerasi Ⲁ.

Un’altra caratteristica fondamentale della replicazione del DNA è che la sintesi è

bidirezionale, cioè procede in entrambe le direzioni, andando a formare la bolla replicativa

e 2 forche replicative. Fotografia al microscopio elettronico del genoma di

Escherichia Coli in replicazione, che è un'unica

molecola di DNA a linea circolare

Da che punto parte la replicazione? da delle sequenze

di DNA molto particolari, sequenza specifico, chiamate

“origini di replicazione” (ORI). Queste vengono

riconosciute dalle proteine che innescano la

replicazione del DNA. Non è detto che la replicazione

parta in modo contemporaneo in tutte le origini. In E.

Coli ne esiste solamente una e si chiama “ori C”. Negli

eucarioti il genoma non è circolare, ma lineare e ogni

cromosoma ha più origini di replicazione,

semplicemente perché se la replicazione partisse da un'unica origine impiegherebbe troppo

tempo e anche perché se la replicazione fallisse non verrebbe mai replicato quel preciso

cromosoma.

L’immagine mostra nell’auto radiografia, una molecola di DNA in attiva replicazione, estratta

da una cellula, nella quale è stata incorporata Timina marcata con trizio. L’elemento emette

radiazioni che impressionano la lastra autoradiografica, mostrando quindi nelle zone dove è

emessa radioattività i punti in cui è partita la replicazione del DNA.

MODELLO A TROMBONE

È chiamato così perché il DNA si ripiega su sé stesso in modo tale che la polimerasi

proceda in modo coordinato su entrambi i filamenti.

La DNA elicasi è la proteina che

rompe i ponti idrogeno.

La PCA è una proteina ad anello che

tiene appiccicata la sul DNA, cioè

aumenta la processività, facendo in

modo che la sintesi del DNA sia un

meccanismo efficiente.

Il singolo filamento è una struttura

molto fragile, per cui sia le cellule

procariotiche che eucariotiche hanno

un enzima che lo riconosce e lo

protegge, chiamato RPA.

I primer a RNA generati all'inizio di

replicazione o all'inizio di ogni

frammento di Okazaki vengono poi

rimossi, una volta che hanno

innescato la sintesi, da dei particolari

enzimi. Questi enzimi, detti DNA ligasi, hanno anche il compito di sintetizzare nuovo DNA

da inserire in quel tratto per riempire il buco che si è generato, per evitare che vi siano

interruzioni.

La molecola di DNA a doppio filamento è molto stabile, ma quando si apre, diventa

estremamente suscettibile al danneggiamento; infatti, la replicazione del DNA è una delle

fasi più fragili per una cellula; per cui deve avvenire in un lasso di tempo non

eccessivamente lungo (ulteriore ragione per la presenza di origini di replicazione multiple).

Quindi l’enzima ricongiunge ogni tratto, riformando il legame fosfodiesterico e questo

avviene in modo contemporaneo al lavoro della polimerasi, cioè man mano che i pezzi

vengono generati.

La DNA polimerasi compie spesso degli errori, per esempio inserendo un’adenina al posto di

una guaina. Per questo motivo l’enzima ha anche un'attività esonucleasica, cioè è in grado

di rimuovere il nucleotide errato da un’estremità “eso” (libera), procedendo in direzione

opposta a quella solita (3’ → 5’). Questa funzione è un'attività estremamente importante

perché diminuisce la frequenza di errore e viene spesso chiamata anche “di correzione di

bozze” o “proofreading”.

LEZIONE 3→ TRASCRIZIONE= sintesi di RNA

RNA viene generato su stampo del DNA ad opera

dell’enzima RNA polimerasi; la trascrizione

avviene in direzione 5’ → 3’. Nei batteri esiste

un'unica RNA polimerasi mentre negli eucarioti ne

esistono 3 specializzate (RNA polimerasi I che

sintetizza gli RNA ribosomiali escluso il 5S, II che

sintetizza l’RNA messaggero e III che sintetizza

tRNA, rRNA 5S e altri piccoli RNA nucleari).

Questo enzima è capace di partire a trascrivere da

zero quindi non necessita un innesco.

Proprietà dell’RNA

I nucleotidi che lo compongono contengono:

-​ ribosio come zucchero

-​ adenina, guanina, citosina e uracile (al posto della timina) come basi azotate

La trascrizione è composta da 3 fasi:

-​ Inizio: Un pezzo di DNA per essere trascritto ha bisogno di un promotore (sequenza

di DNA) a monte, detta ORF (Open Reading Frame), che ha il compito di aumentare

l’affinità con l’RNA polimerasi, che gli si attacca

-​ Allungamento: la molecola DNA stampo è in direzione 3’→5’, quindi il trascritto è

prodotto in direzione 5’→3’ e la molecola che si genera è 3’→5’ (come lo stampo)

-​ Fine: esistono vari meccanismi di terminazione, alcuni ad opera del terminatore di

trascrizione (rho), che possiede sequenze

ricche di GC seguite da almeno 6 coppie di basi

AT; questo stacca i trascritti e la RNA polimerasi.

La terminazione del trascritto può quindi essere:​

• Rho-indipendente: l’mRNA trascritto presenta

delle sequenze terminali palindromiche, che

quindi possono appaiarsi formando una struttura

a forcina che favorisce il distacco dalla molecola di DNA. La sequenza termina con

molti uracile, che sono legati solo da 2 ponti idrogeno con l’adenina del DNA, quindi

possono facilmente essere rotti

• Rho-dipendente: quando le sequenze finali del’mRNA sono ricche di citosine

diventa più complicato il distacco dal DNA stampo, in questi casi infatti interviene la

proteina rho che ha attività elicasica. Essa quindi si lega all’mRNA e scorre in

direzione 5’→3’ fino a raggiungere la RNA-polimerasi e determinare il distacco tra

RNA e DNA. La molecola di mRNA viene modificata in seguito alla trascrizione con

l’aggiunta di un CAP all’estremità 5’ e di una coda di poli-A

In ogni caso la trascrizione continua oltre il codone di stop e poi viene staccata. Nei

procarioti la trascrizione è associata alla traduzione, mentre negli eucarioti NO!

Il codice genetico

-​ composto da triplette, cioè codoni

-​ è quasi universale

-​ è degenerato ma non è ambiguo

-​ contiene codone d’inizio (AUG= metionina) e 3 codoni di fine (UAA, UAG, UGA)

ELEMENTI FONDAMENTALI DI UN GENE

Potenziale esercizio d’esame!!

La sequenza riportata contiene l’inizio della regione codificante di un gene. E’ indicata solo

l’elica complementare a quella che fa da stampo per l’RNA polimerasi. Trascrivi e traduci.

Procedimento:

1.​ partire dall'inizio a trascrivere!

2.​ trasformare il DNA in RNA (U al posto di T)

3.​ tradurre aminoacidi con tabella

LEZIONE 4→ codice genetico e traduzione

Quando avviene un inserzione di più nucleotidi o una delezione di 1 o 2, in un gene, cambia

tutto il filamento di DNA perché avviene uno slittamento (frameshift), mentre invece se

vengono aggiunti /rimossi 3 nucleotidi, questo non avviene perché verrà semplicemente

aggiunto l’amminoacido corrispondente a quel codone e non cambia la “finestra di lettura”.

Si può anche avere il cambio di un solo nucleotide (cambiamento di base), che non

comporta necessariamente la lettura di un diverso aminoacido poiché il codice è

degenerato, oppure nonostante cambi l’amminoacido potrebbe non compromette la

funzionalità biologica della proteina, poiché esistono amminoacidi che hanno proprietà simili

(es: acido glutammico e acido aspartico).

tRNA molecola trascritta e non tradotta

➔​ struttura: ha una regione denominata anticodone, che si appaia al codone di RNA;

sull’estremità 3’ è legato l’aa che sarà inserito nella catena

La reazione di caricamento dell’aa sul tRNA è catalizzata dall’enzima aminoacil tRNA

sintetasi, richiede ATP e forma aminoacil AMP, liberando pirofosfato.↴

Altro componente fondamentale del

processo di traduzione sono i

ribosomi, che si legano al rRNA

(ribosomiale), molecola trascritta e

non tradotta: sono costituiti da una

subunità minore e una subunità

maggiore. Dopo che la subunità

minore si è insediata, viene

raggiunta dalla maggiore (nei

procarioti) e il ribosoma complessivo

arriva a coprire 3 triplette. Il ribosoma

si muove sul RNA sempre nella

direzione 5’→3’.

Nei procarioti l’RNA ribosomiale 16S

ha una regione che si appaia con la

sequenza di Shine-Dalgarno (sul

mRNA da tradurre), la quale rende la

molecola più facilmente traducibile e

la traduzione più efficiente.

Nella molecola di mRNA si

distinguono delle triplette chiamate

sito E, sito P e sito A. In primo luogo la subunità minore del ribosoma riconosce

la tripletta AUG sull’mRNA, i