Appunti di Chimica organica sul DNA

L T W

= +

esempio, un anello di DNA che possiede globalmente un giro di torsione in eccesso rispetto a

quello che sarebbe il suo stato normale di avvolgimento si potrà trovare in due diverse situazioni

estreme (e in quelle intermedie): o avrà tutto lo stress torsionale immagazzinato in una torsione

intorno al suo asse, che risulterà in un minor numero di basi per giro (T=+1, positivo) e allora il

! suo asse potrà rimanere nella conformazione planare circolare (W=0, L=T+W=1), oppure potrà

rilassare la sua torsione intorno all’asse al valore naturale e allora il suo asse si attorciglierà a

forma di 8 (T=0, W=+1, L=1 Fig. 4.1 (b)). Per valori di L maggiori si formeranno strutture lineari

con un maggior numero di anse (plectonemiche) o strutture toroidali o solenoidali, oppure una

combinazione di queste.

Fig 4.2 (a) Struttura di una topoisomerasi (Tipo IA). Sono mostrate le due conformazioni di sito aperto

e chiuso coinvolte nel meccanismo di azione (b)

Lo stato superavvolto è comune: mediamente il DNA si trova in uno stato di supercoiling negativo

con densità di superavvolgimento pari a circa 1 giro in eccesso ogni circa

/L

" = #L = $0.06

0

200bp ( è il valore di giri nella situazione rilassata e è il suo valore in eccesso). Ad

L L L

"L = #

0 0

esempio, con questo valore di , un cromosoma mitocondriale con circa 16000 bp avrà

" "L # $80

e potrà formare un’ottantina-cento anse. I plasmidi possono essere molto più piccoli (1000-2000

bp) e formare un numero di anse dell’ordine di 10 (Fig 4.1 (c-e)). Una funzione del

!

superavvolgimento è la compattazione della struttura del DNA, che altrimenti avrebbe estensione

! !

macroscopica. Si noti che, nonostante superavvolgimenti sia positivi che negativi assolverebbero

! !

ugualmente bene questa funzione, il valore della medio della densità di superavvolgimento è

normalmente negativo. Il motivo è che la torsione negativa (che tende a svolgere l’elica) favorisce

9

la separazione delle catene (Fig 4.1 (e)) e l’azione delle polimerasi (Fig 4.1 (d)), mentre quella

positiva la impedisce. Questo valore è quindi un compromesso per mantenere la necessaria debole

stabilità della doppia elica rispetto a denaturazione, di cui si è ampiamente già discusso. Esso

viene modificato e/o mantenuto da speciali enzimi (topoisomerasi e girasi) che tagliano, torcono e

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risaldano il DNA, in pratica variando il valore di L . La loro azione si rende necessaria ad esempio

durante la trascrizione, quando lo stress torsionale varia per effetto delle polimerasi, che svolgono

localmente la doppia elica. Tutto quanto detto vale anche per DNA non circolari, dal momento che

in generale tratti anche lunghi di doppia elica hanno le estremità bloccate. In particolare, nel DNA

nei cromosomi eucariotici la compattazione è ottenuta con un superavvolgimento di tipo

solenoidale intorno alle proteine istoniche, come vedremo piú avanti.

9

(a)

(b) (c)

(d) (e) (f)

Fig 4.3 (a) Due tipici elementi di struttura terziaria (nell’ordine, pseudoknot e kissing loops) e un esempio di

topologia complessa (b) tRNA (c) ribozimi con funzione di rottura del legame fosfodiestere: hammerhead

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(primi due), hairpin, e il ribozima dell’epatite D (HDV) (d) introne con funzione auto-catalitica di self-splicing

(e) Ribonucleasi P (f) RNA ribosomiale: diagramma delle strutture delle sottounità e struttura del ribosoma.

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Nell’RNA, come già accennato, il ripiegamento in strutture terziarie con specifiche forme

tridimensionali ha principalmente ruoli funzionali. Per questo motivo, mentre il DNA superavvolto

può avere una struttura piuttosto “fluttuante” (ad esempio le anse delle strutture plectonemiche si

muovono) stabilizzata solo da interazioni di tipo “non-bonded”, in RNA la struttura terziaria ha la

necessità di essere stabilmente mantenuta. I tratti di elica e gli altri motivi strutturali secondari

vengono mantenuti in posizioni e orientazioni relative stabili da accoppiamenti tra nucleotidi, che

possono essere di tipo WC, oppure wooble o altro, ma comunque sono di tipo piuttosto specifico e

coinvolgono solitamente almeno un legame a idrogeno tra basi. Alcune possibili topologie di

formazione di strutture terziarie sono mostrate (Fig 4.3 (a)). Accoppiamenti estesi tra singoli

strand e doppie eliche possono avvenire tramite la formazione di tratti di elica tripla. Sono anche

possibili ccoppiamenti tra doppie eliche parallele, tramite l’inserimento dei grooves l’uno nell’altro.

Da quanto si è detto fin’ora sulle diversità tra DNA e RNA dovrebbe essere chiaro come questo sia

possibile e avvenga piú facilmente in RNA piuttosto che in DNA: l’RNA può piú facilmente formare

sia accoppiamenti non standard, sia strutture secondarie diverse dalla doppia elica, piú propense a

contatti di tipo terziario. Alcuni esempi di strutture terziarie tipiche sono riportati in Fig 4.3. Il

tRNA (RNA transfer, Fig 4.3 (b)) è un esempio di struttura relativamente semplice, ma di

fondamentale importanza: esso è la molecola chiave che realizza la decodificazione del codice

genetico durante la traduzione dell’RNA messaggero (mRNA) in proteina, che avviene all’interno

del ribosoma, come vedremo in dettaglio nella prossima sezione. I tre hairpin e il piccolo loop

sono arrangiati in una struttura compatta con due estremità chiaramente riconoscibili: una di esse

porta l’anticodone, cioè un loop con una tripletta complementare a quella codificante un

amminoacido che è legato all’altra estremità. Esistono dunque diversi tRNA per i diversi

amminoacidi. (b)

(a) (c)

Fig 5.1 (a) Organizzazione gerarchica della struttura compatta del DNA. (b) Livello intermedio di

compattazione: l’esamero di nucleosomi. (c) il nucleosoma: DNA in verde-ocra, proteine istoniche in blu-

verde-giallo-rosso. È visibile la coda degli istoni.

Un’altra classe importante di RNA funzionali sono i ribozimi, ovvero RNA con funzione enzimatica.

Fig 4.3 (c) riporta alcuni esempi di ribozimi di vari virus la cui funzione è la rottura del legame

fosfodiestere in maniera sequenza-specifica. A differenza degli enzimi idrolizzanti, in questo caso il

meccanismo di reazione è l’isomerizzazione del legame. A funzioni piú complesse e secifiche

corrispondono ovviamente strutture piú complesse. Alcuni introni (Fig. 4.3 (d)) hanno funzione di

operare lo splicing dei propri esoni, mentre la ribonucleasi P è una nucleasi altamente specifica

che “matura” il tRNA separando una parte del suo precursore. Infine, le sottounità ribonucleiche

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che compaiono nei ribosomi (Fig 4.3 (f)) in associazione con catene polipeptidiche, globalmente

chiamate RNA ribosomiale (rRNA) sono altamente strutturate e assolvono specifiche fasi durante

la traduzione e sintesi proteica. Accenniamo infine agli aptameri, ovvero catene foldate di RNA con

funzione di riconoscimento molecolare, che fanno di solito parte di strutture funzionali piú

complesse.

5. Struttura quaternaria

La struttura quaternaria riguarda il modo in cui le singole catene ripiegate o accoppiate in doppie

eliche si combinano a formare un complesso, che può assumere anche dimensioni molto grandi.

Data la loro carica netta positiva, grandi complessi composti esclusivamente da acidi nucleici

difficilmente potrebbero essere stabili, dunque, specialmente quando le dimensioni del complesso

sono dell’ordine di decine di nm, DNA e RNA normalmente si trovano in associazione con proteine,

che assumono il doppio ruolo di elementi funzionali e stabilizzanti. Questi agglomerati

macromolecolari costituiscono il “macchinario cellulare”, cioè un insieme di nano-bio oggetti che

svolgono tutte le funzioni cellulari. La loro varietà e la complessità è vasta. Nel seguito verranno

illustrati due esempi specifici e di enorme importanza: il nucleosoma e il ribosoma.

Nelle cellule, il materiale genetico è normalmente organizzato in una forma strutturale compatta

(Fig 5.1). La compattazione è necessaria dal momento che le singole catene di DNA possono

raggiungere dimensioni macroscopiche (cm) e l’intero genoma può arrivare ad una estensione

lineare di metri. Il nucleosoma è l’unità base di compattazione e consiste di due giri di DNA per

una lunghezza totale di circa 150-200bp (40-50nm) avvolti intorno ad un ottamero di proteine

istoniche (H2A, H2B, H3 e H4). I singoli nucleosomi si susseguono e il sistema assume l’aspetto di

una collana di perline. I nucleosomi sono poi organizzati in esameri (Fig. 5.2 (b)) compattati da

altri istoni (H1) e arrotolati in una struttura globalmente solenoidale, la fibra di cromatina, Fig 5.2

(a). Durante la mitosi cellulare e piú specificamente nella metafase le fibre sono compattate in

strutture macroscopiche ordinate chiamate cromosomi, mentre nell’interfase, quando avviene la

duplicazione del DNA, la cromatina deve ovviamente scompattarsi. Questi cambiamenti strutturali

visibili su scala macroscopica sono causati in ultima analisi da variazioni degli istoni, regolate da

specifici enzimi: questi, dipendentemente dalle condizioni ambientali possono cambiare

chimicamente la “coda” dell’istone (tratto terminale destrutturato), tramite metilazione,

acetilazione o altro. Questo comporta una variazione strutturale che a sua volta induce lo

srotolamento del DNA e la dissociazione dei nucleosomi. (b)

(c)

(a)

Fig 5.2 (a) Schema della fase di elongazione della sintesi proteica (b) struttura schematica del ribosoma con

evidenziate le due sottounità, l’mRNA, il tRNA e i suoi tre siti di legame e il peptide in formazione (c) una

rappresentazione in cartoon del ribosoma. Le catene proteiche sono rappresentate in rosa, quelle di acidi

nucleici in blu. L’mRNA e il tRNA sono in arancio e verde.

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Come già accennato, il ribosoma è un complesso macchinario cellulare che opera la traduzione

dell’RNA messaggero (mRNA) e la sintesi proteica. Fig. 5.2 (a) riporta la fase dell’elongazione

della catena peptidica quando il processo è già iniziato. L’mRNA è legato in una regione tra le due

sottounità (chiamate piccola e grande, si veda Fig. 5.3 (b)). Dei tre siti di legame per il tRNA

almeno uno è sempre occupato dal tRNA con l’amminoacido appena aggiunto. Il tRNA successivo

si lega al sito adiacente, ma solo un tRNA con l’anticodone corrispondente al codone di mRNA

esposto nel sito in quel momento si può legare. Una volta legato, il suo amminoacido si trova in

posizione adiacente a quello della catena peptidica già formata e avviene la reazione di formazione

del legame peptidico, tramite trasf