Appunti completi di Analisi dei Farmaci e dei loro metaboliti nei fluidi biologici

ANALISI DEI FARMACI E DEI LORO METABOLITI

Lezione 1 (1/10 ppt 0)

A F M M B :

NALISI DI ARMACI E ETABOLITI IN ATRICI IOLOGICHE OBIETTIVI E FATTORI

’

DETERMINANTI NELL ANALISI

O 'A

BIETTIVI DELL NALISI

Gli obie ivi principali dell'analisi sono diversi, tra cui:

Scienze Forensi: Indagini su casi di avvelenamento, overdose, ecc.

 Doping: Rilevazione di sostanze dopanti in atleti.

 Monitoraggio Terapeutico: Controllo dei livelli di farmaci per o imizzare la terapia.

 Farmacocinetica e Farmacodinamica: Studi sull'assorbimento, distribuzione, metabolismo ed escrezione dei

 farmaci.

F D 'A

ATTORI ETERMINANTI NELL NALISI

Diversi fa ori influenzano la scelta del metodo analitico:

Tempo: La rapidità dell'analisi è cruciale in situazioni di emergenza, come overdose.

 Costo: Il costo dell'analisi può variare a seconda della tecnica utilizzata e della disponibilità di risorse.

 Certificazione: Alcune analisi (es. antidoping) richiedono laboratori certificati secondo standard specifici (es.

 ISO).

Esempio Pratico: In un caso di overdose, si privilegerà un'analisi rapida per identificare la sostanza e somministrare

l'antidoto, anche a costo di una minore precisione. In uno studio di farmacocinetica, si potrà utilizzare un'analisi più

accurata, anche se più lunga.

M B : S M P

ATRICI IOLOGICHE ANGUE COME ATRICE RIMARIA

Il sangue è la matrice biologica più utilizzata per l'analisi di farmaci e metaboliti. È possibile utilizzare test

qualitativi rapidi (es. test colorimetrici) per una prima identificazione, oppure analisi quantitative specifiche per

determinare la concentrazione esa a della sostanza.

I P A

L ROBLEMA NALITICO

L'analisi viene effe uata solo in risposta a un problema analitico, ovvero una specifica richiesta di analisi, ad es. un

controllo antidoping di un atleta in seguito a richiesta di analisi per rilevare sostanze dopanti.

R P A : U A S

ISOLUZIONE DEL ROBLEMA NALITICO N PPROCCIO ISTEMATICO

1. Materiale:

Valutare il materiale di partenza (es. goccia di sangue secco) per determinarne l'idoneità all'analisi.

 Effe uare un campionamento adeguato per o enere un campione rappresentativo.



2. Pretra amento:

Purificare il campione per rimuovere interferenze e concentrare l'analita.

 Tecniche comuni: Precipitazione delle proteine, estrazione liquido-liquido (LLE), estrazione in fase solida

 (SPE).

La scelta del pretra amento dipende dall'urgenza dell'analisi.



3. Analisi:

Inserire il campione tra ato nello strumento analitico.

 O enere un risultato (valore).



4. Interpretazione:

Analizzare il valore o enuto e trarre conclusioni.

 Questa fase richiede competenze specifiche e un'interpretazione chimica dei dati.

 Comunicare i risultati al richiedente (es. medico, giudice).



5. Decisione:

Basata sui risultati dell'analisi, prendere una decisione (es. conferma di doping, diagnosi di

 avvelenamento).

L'analista deve possedere un alto grado di autonomia nel risolvere il problema analitico. Spesso, un problema

analitico non è facile da risolvere e richiede la ripetizione di prove o la scelta di un metodo alternativo. È

fondamentale saper interpretare la richiesta di analisi e scegliere il metodo più appropriato.

C C I

AMPIONI OMPLESSI E NTERFERENZE

I campioni biologici sono complessi e contengono molte sostanze oltre all'analita di interesse. È importante

distinguere tra la matrice (il fluido biologico) e l'analita (il farmaco o metabolita).

Le interferenze possono alterare il risultato dell'analisi e portare a conclusioni errate. Esempio: Analisi del

calcio nell'acqua con interferenza del magnesio.

Analogia: Immaginate di cercare un ago in un pagliaio. Il pagliaio è la matrice complessa, l'ago è

 l'analita. Bisogna trovare un modo per isolare l'ago dal pagliaio per poterlo identificare.

A M L

SPETTI ERCEOLOGICI E EGISLATIVI

Il tipo e la provenienza del campione sono importanti per valutare la precisione dell'analisi. La precisione richiesta

dipende dalla quantità dell'analita e dal contesto dell'analisi.

Gli aspe i legislativi (es. laboratori certificati, validazione dei metodi) influenzano la scelta del metodo analitico.

Esempio: Analisi del potassio nel sangue vs. nel fertilizzante.



La le eratura scientifica è una risorsa preziosa per trovare metodi analitici, modificarli o idearne di nuovi. Si può

trovare un metodo già confezionato, modificarlo o idearne uno nuovo.

Esempio: Analisi del Fentanil, una sostanza molto potente e difficile da analizzare, richiede metodi specifici e

 innovativi.

A A

MBITI DI PPLICAZIONE

L'analisi di farmaci e metaboliti trova applicazione in diversi ambiti tra cui chimica farmaceutica, farmacologia,

monitoraggio terapeutico, tossicologia e scienze forensi.

Q D F F B ?

UANDO OSARE UN ARMACO IN UN LUIDO IOLOGICO

Per determinare l'esposizione a farmaci (in uso dal paziente) o sostanze psicoa ive (anche droghe).

 Per lo sviluppo e la ricerca di farmaci, per studiarne la farmacocinetica, la farmacodinamica e il metabolismo



Esempio: Analisi di benzodiazepine in un tentativo di suicidio.

A S F

PPLICAZIONI NELLE CIENZE ORENSI

Le scienze forensi sono un campo importante per l'analisi di farmaci e metaboliti. L'analisi su matrici biologiche è

l'unico modo per quantificare l'esposizione a sostanze in casi legali. È importante distinguere tra test qualitativi

(presenza/assenza di una sostanza) e test quantitativi (concentrazione della sostanza).

Esempio: Ricerca di sangue nel lavandino con Luminol (test qualitativo) o identificazione della sostanza causa

 di decesso (analisi tossicologica).

P S F

ROBLEMATICHE NELLE CIENZE ORENSI

Un problema comune è l'identificazione di sostanze sconosciute. Si a uano perciò screening test, a i all’analisi di

tu e le sostanze per identificare la classe di sostanze presente/i. la cosa importante da fare è riuscire ad escludere

sostanze che non sono la causa della morte.

Esempio: Trovata digossina (farmaco per il cuore), ma la causa della morte potrebbe essere un'altra.



A : C S R

VVELENAMENTI ASI TORICI E ECENTI

Gli avvelenamenti sono un problema antico e moderno, di cui un esempio è il deli o della minestrina a San Lorenzo,

caso di presunto avvelenamento con cianuro. Il cianuro è un veleno noto che inibisce la citocromo ossidasi

mitocondriale. Altri esempi sono casi di medici che avvelenano i pazienti con la morfina e il caso del Tylenol.

La storia è piena di casi di avvelenamento, spesso legati a intrighi politici o personali. La conoscenza dei veleni e delle

loro modalità d'azione è sempre stata un'arma potente.

Ricerca di Sostanze nel Sangue: Un Approccio Costante

La ricerca di sostanze nel sangue è una pratica consolidata nella storia. La tecnologia moderna ha permesso di

migliorare la precisione e la sensibilità delle analisi.

E A T L P

SEMPIO DI NALISI OSSICOLOGICA IN ABORATORIO RIVATO

Analisi di screening per le classi di sostanze (es. barbiturici, benzodiazepine, oppioidi) con tecniche

 immunochimiche.

Analisi mirate per le singole sostanze.

 Analisi su campioni multipli (urina e sangue) per risultati completi.



Il prezzo dell'analisi aumenta con la specificità e l'accuratezza.

Appunto Utile: La scelta del metodo analitico dipende dalla domanda e dalle risorse disponibili. Un

 laboratorio di analisi deve essere in grado di offrire una gamma di servizi per soddisfare le diverse

esigenze.

I D M : U C I

L ELITTO DELLA INESTRINA N ASO SPIRATORE

Il deli o della minestrina è un caso di cronaca nera che ha ispirato molte riflessioni sull'analisi tossicologica. Il caso

non è mai stato risolto, ma si pensa che la vi ima sia stata avvelenata con cianuro. Il cianuro è un veleno che ha la

particolarità di essere incolore e di avere un odore di mandorla amara. L'acido cianidrico si lega al ferro

dell'emoglobina, impedendo il trasporto dell'ossigeno e causando la morte per asfissia cellulare.

I D M : E C

L OTTOR ORTE UTANASIA RIMINALE

Il caso del "do or morte" è un esempio di abuso della professione medica. Il medico inie ava morfina in dosi

eccessive a pazienti anziani, causando la loro morte. Il caso è stato scoperto grazie alla presenza di un foro nella

coscia di una delle vi ime. Questo caso solleva importanti questioni etiche e legali sull'eutanasia e sul ruolo del

medico.

I C T : U A F P

L ASO DEL YLENOL N TTACCO ALLA IDUCIA UBBLICA

Il caso del Tylenol è un esempio di a acco terroristico che ha preso di mira un prodo o di consumo di massa. Nel

1982, se e persone morirono a Chicago dopo aver ingerito capsule di Tylenol contaminate con cianuro. L'evento

portò al ritiro di milioni di confezioni di Tylenol e all'introduzione di nuove misure di sicurezza per i farmaci da

banco. Questo caso ha avuto un impa o duraturo sulla fiducia dei consumatori nei prodo i farmaceutici e alimentari.

Lezione 2 (17/10 ppt 1-2)

I : ,

PROTAGONISTI FARMACI STUPEFACENTI E I LORO METABOLITI

Cambiano a seconda della scena che si me e in a o, si possono cercare farmaci (drugs, sostanze biologicamente

a ive) o stupefacenti o i loro metaboliti. Questi sono fondamentali perché:

Ci sono sostanze che si riconoscono grazie ad essi.

 Ci sono sostanze che non sopravvivono come tali nelle matrici, perciò i metaboliti ci diranno la sostanza

 inserita.

Si cercano nel monitoraggio terapeutico, overdose, doping e nuove sfide.

Il monitoraggio di un farmaco si effe ua quando questo ha una finestra ristre a, cioè la distanza tra la minima dose

efficace e la massima dose tossica è molto piccola, oppure quando si ha la necessità di individuare un livello di una

sostanza o farmaco all’interno di un corpo che sia sufficiente per tu a la durata della terapia. Si monitorano solo

alcuni farmaci: per farmaci di uso comune non si dosa, mentre i cardioa ivi sono la prima classe da monitorare.

Q TDM ( )?

UALI SONO QUINDI I FARMACI SOGGETTI A TERAPEUTIC DRUG MONITORING

F C

ARMACI ARDIOATTIVI

Servono per l’uso terapeutico di angina, aritmia, mala ie del sistema cardiorespiratorio.

esempio, digitossina, digossina, chinidina.

 Hanno stru ure diverse perché appartengono a gruppi farmaceutici diversi. I

digitalici hanno un basso indice terapeutico e richiedono monitoraggio: si

monitora la concentrazione nel sangue perché la concentrazione della

digitossina è molto ristre a. Questa provoca la morte per aritmia: si accumula

Ca²⁺ intracellulare, si blocca la conduzione cardioventricolare iperkaliemia.

→

Ogni 100.000 pazienti si hanno 5000 ricoveri con intossicazioni del 3%.

A NTIBIOTICI

La tubercolosi deriva da un ba erio difficilmente eradicabile; qui

la terapia antibiotica dura anche per anni. Quando si assume un

farmaco per così tanto tempo, bisogna controllarne l’efficacia:

bisogna controllare la classe del farmaco da dosare, ma anche il

suo utilizzo e la finestra.

Tra gli antibiotici abbiamo la gentamicina, usata e somministrata a intervalli regolari, con la dose successiva

somministrata quando la concentrazione della precedente diminuisce.

Il dato è molto sogge ivo, ecco perché è importante dosarlo: potrebbe esserci la sovrapposizione della dose nel caso

in cui la prima non sia stata eliminata nel tempo, oppure potrei avere una metabolizzazione più veloce e sarebbe

necessario introdurre una seconda dose più rapidamente.

Gli antibiotici vengono presi a dosi regolari perché si va a interferire con la vita del ba erio. Il ciclo vitale viene

seguito fino a che il ba erio, intaccando la sua parete cellulare, non muore: serve una terapia mirata con una dose

sufficiente, altrimenti rimarrà dormiente e latente. Di solito, per le mala ie e ba eri comuni, sono necessari 5 giorni,

altrimenti di più.

A NTIEPILETTICI

Le persone affe e da epilessia possono avere una vita regolare se prendono un farmaco che copra tu o l’intervallo

della giornata. Tali farmaci sono a rilascio prolungato e somministrati una volta al giorno, altrimenti ma ina e sera

per una copertura completa. La crisi epile ica, non mortale di per sé, può essere pericolosa per situazioni di vita

comune: il sogge o epile ico, prendendo un farmaco senza effe i collaterali pesanti, può vivere normalmente senza

convulsioni, ma ciò è sogge ivo. Ci sono infa i molti casi di resistenza e molti pazienti che, esclusi tali farmaci,

hanno bisogno di prenderne di più o diversi.

Si hanno ad esempio, fenobarbital, acido valproico, come anche quelli di nuova generazione, continuamente

 sintetizzati per migliorare la situazione del paziente epile ico. L’acido valproico, il più utilizzato, ha effe i

collaterali pesanti, perciò si cercano alternative.

La terapia dell’epilessia si presta al monitoraggio

terapeutico, sia per il decorso della mala ia, sia per le

cara eristiche dei farmaci. Il loro indice terapeutico è basso e

la cinetica è variabile: persone diverse hanno tale farmaco

metabolizzato in tempi e velenosità differenti.

I farmaci più noti hanno un intervallo terapeutico molto

diverso tra loro: a seconda del tipo di farmaco si andrà a

monitorare la presenza nel sangue e controllare se la dose sia

giusta. Per molti farmaci è necessario un controllo ematico del fegato, perché molti intervengono a questo livello e il

paziente epile ico potrebbe effe uare un unico controllo per verificare le transaminasi (che il fegato stia lavorando

bene) e il monitoraggio terapeutico.

A LTRI TIPI DI FARMACI SOGGETTI A MONITORAGGIO

Possiamo controllare broncodilatatori, come teofillina e caffeina. Il trapianto di organo necessita di

immunosoppressori per evitare il rige o: qui la terapia è prolungata e bisogna controllare il decorso.

Anche i farmaci antitumorali vengono somministrati per tempi molto lunghi: le chemioterapie, per quanto utili per

comba ere il tumore, sono nocive per altro. Anche i farmaci psichiatrici, usati per depressione, schizofrenia o anche

emicrania (antipsicotici), tra cui l’acido valproico, e il litio per il disturbo dell’umore.

F ARMACI E DROGHE COINVOLTI NEI DECESSI PER OVERDOSE

Fentanil ed eroina sono i grandi protagonisti, ma anche metadone, morfina, diazepam, cocaina, benzodiazepine,

metanfetamina… La somministrazione dipende dal tipo di utilizzo: la persona che vuole uccidersi assume dosi

altissime, perciò il monitoraggio si applica al momento del ricovero in ospedale; ma una persona può anche sbagliare

e assumere più volte la dose del farmaco, oppure una persona in disintossicazione da eroina che assume metadone.

FENTANIL

Il fentanil è la droga che al momento spopola negli USA e in Italia si affaccia sempre di più. È un oppioide sintetico,

sintetizzabile facilmente in laboratorio (prezzo molto più basso dell’eroina); è 100 volte più forte dell’eroina e 50

della morfina. La dose letale ha una concentrazione molto bassa (2 mg),

quindi il suo indice terapeutico è molto basso: la morte può avvenire anche per

conta o o intossicazione in laboratorio (fumi).

Il fentanil nasce come sostanza medicale, so o prescrizione, e il suo utilizzo

deve essere giustificato. Nella terapia del dolore, sostanze come morfina,

derivati o fentanil vengono utilizzate per ridurre i livelli di dolore, sopra u o

nel caso di mala ie a livello terminale, per accompagnare i pazienti verso una

morte più dolce. Qui il fentanil è molto utile, ma non senza uno stre o controllo, altrimenti la situazione

peggiorerebbe. La sua emivita è di 1–3,5 ore. Si o iene un suo metabolita

subito, il , relativo a una N-dealchilazione

NORFENTANIL

ossidativa dell’azoto piperidinico. Il norfentanil si rileva a 0,3–

0,7 ng/ml, ma la fortuna è di poterlo dosare anche fino a 96 ore

dall’assunzione.

La problematica è che viene so o forma di molti analoghi, i quali subiscono la

SINTETIZZATO CLANDESTINAMENTE

stessa reazione e danno luogo al norfentanil: i metaboliti perciò non sono unici per ciascun analogo del fentanil, per

identificare corre amente l'agente di esposizione, non è possibile basarsi solamente sui metaboliti trovati alla fine

dell’analisi strumentale, è necessario monitorare anche l’analogo di partenza del fentanil. Bisogna cercare altri

metaboliti per capire il prodo o vero di partenza (come per le benzodiazepine che, avendo stru ura similare, non

perme ono di capire il prodo o originale).

Fentanil e derivati sono al momento diffusissimi nel mondo e in Italia. Sono molto utili GC e HPLC-MS per

monitorare tali composti sintetici analoghi del fentanil. Con queste tecniche è possibile, in pochi minuti, misurare la

concentrazione di tantissimi derivati di tale droga.

BENZODIAZEPINE Lo stesso discorso del fentanil si fa per le benzodiazepine, ansiolitici, spesso riscontrabili

nel sangue di pazienti sogge i a intossicazione da sostanze psicoa ive. Spesso

compaiono insieme ad altri composti, perciò la sfida più grande sarà determinare più set di

sostanze nella stessa corsa cromatografica o analisi.

Il problema delle benzodiazepine e dell’intossicazione relativa è che normalmente il

paziente diventa dipendente, sia per colpa del medico che non conosce esa amente la

parte farmacologica delle BDZ, sia del paziente. All’inizio del tra amento si ha un effe o

positivo ne o (un paziente affe o da ansia ha un effe o benefico), che dura per tu o il

tra amento di circa 3–6 mesi.

Con il tra amento prolungato si hanno sintomi

astinenziali, si ha un picco positivo e poi

discendente: il paziente vuole assumere una

conc