Appunti Biologia molecolare

Genoma

Genoma – patrimonio genetico dell’organismo, organizzato fisicamente in cromosomi e funzionalmente in geni.

Genoma nucleare – raggruppato in 24 molecole lineari, ossia 22 autosomi e 2 cromosomi sessuali.

Genoma mitocondriale – molecola di DNA circolare.

Genoma procariotico: piccole dimensioni, singola molecola di DNA circolare, pochi geni, non sono presenti introni quindi tutto quello che è presente viene trascritto.

Genoma eucariotico: genomi più grandi di quelli procariotici, DNA lineare localizzato nel nucleo e organizzato in una struttura super avvolta (cromatina). Presenza di proteina istoniche e sequenza ripetute che non codificano proteine tra cui sequenze altamente ripetute, sequenze moderatamente ripetitive e trasposoni.

Struttura RNA

Ribosio invece di desossiribosio, uracile invece di timina il quale lega l’adenina, singola catena semplice invece di doppia elica. Struttura tridimensionale più svariata di quella del DNA. Gruppo ossidrilico legato al carbonio 2.

Diverse specie di RNA

• mRNA messaggero – molecola prodotta dalla trascrizione e contiene il codice genetico sul sito della sintesi proteica.
• tRNA transfer o di trasporto – presenta molecole a forma di trifoglio ciascuna delle quali porta un amminoacido specifico. Struttura secondaria a trifoglio, risultante dall’appaiamento delle basi complementari. Questa struttura comprende uno stelo costituito dalle due estremità della molecola sulla quale si legheranno gli amminoacidi specifici e tre anse. Di queste quella centrale opposta allo stelo contiene l’anticodone.
• rRNA ribosomiale – costituente dei ribosomi. I grandi RNA sono formati da grandi domini strutturali che si assemblano e si ripiegano in modo indipendente e vanno a costituire strutture terziarie. Tra cui il motivo a pseudonodo una singola ansa forma coppie di basi con sequenze complementari non contigue. Questa interazione porta alla formazione di doppie eliche (quella dello stelo e quella derivante dall’interazione tra ansa e sequenze non contigue). Un esempio importante è costituito dal motivo a pseudonodo della telomerasi umana, rete intricata di interazioni terziarie, la quale forma una struttura a tripla elica stabilizzata da triplette di basi.

Struttura DNA

Molecola polimerica costituita da nucleotidi. Ogni nucleotide è formato da: una base azotata, uno zucchero pentoso (5 atomi di carbonio) e un gruppo fosfato. Tipo di zucchero deossiribosio. Idrogeno legato al carbonio 2.

Basi azotate

• Purine – strutture a doppio anello costituite da 9 atomi di carbonio (adenina e guanina).
• Pirimidine – strutture a singolo anello costituite da 6 atomi di carbonio (timina, citosina e uracile).

Le basi azotate sono sempre legate al carbonio 1’ dello zucchero pentoso tramite un legame glicosidico che coinvolge l’azoto in posizione 1’ delle pirimidine e l’azoto in posizione 9’ delle purine. Zucchero + base = nucleoside. Zucchero + base + fosfato al carbonio 5’ del pentoso = nucleotide. Più nucleotidi sono uniti in catene polinucleotidiche tramite legami covalenti noti come legami fosfodiesterici, quest’ultimo si forma tra l’ossidrile in posizione 3’ di un nucleotide e il gruppo fosfato del carbonio 5’ del nucleotide successivo. Questo legame essendo forte richiede energia per essere formato, quest’ultima è fornita dai deossiribonucleosidi 5’-trifosfato (substrati della DNA polimerasi). E’ formato da una base azotata che si lega allo zucchero più tre gruppi fosfato che si legano al carbonio 5’. Quattro sono i deossiribonucleosidi 5’-trifosfato: “deossiATP” (dATP), “deossiTTP” (dTTP), “deossiGTP” (dGTP) e “deossiCTP” (dCTP). Sono quindi gli stessi ribonucleosidi 5’ trifosfato che entrando nella reazione di sintesi vengono idrolizzati liberando pirofosfato. L’idrolisi del pirofosfato è catalizzata dalla pirofosfatasi in due gruppi fosfato.

Doppia elica DNA

Nel 1953 Watson e Crick proposero il modello tridimensionale a doppia elica del DNA. Le scoperte su cui si basarono per formulare il loro modello furono due: Gli studi sulle basi azotate di Chargaff e quelli sulla diffrazione a raggi X condotti da Franklin e Wilkins. Watson e Crick proposero un modello in cui il DNA è costituito da due catene polipeptidiche elicoidali avvolte attorno allo stesso asse per formare una doppia elica destrorsa e le due catene si associano tramite legami idrogeno tra le basi azotate. Abbiamo un appaiamento tra le basi dette quindi complementari. Si formano tre legami idrogeno tra G e C e due tra A e T. Secondo questo modello le due catene corrono in direzione opposta e pertanto sono dette antiparallele. Infatti una decorre con andamento 5’-3’ mentre l’altra 3’-5’. Gli scheletri di zucchero-fosfato si trovano all’esterno della doppia elica mentre le basi azotate sono orientate verso l’asse centrale. Attraverso gli studi a diffrazione ai raggi X sono stati rilevati due tipi differenti di strutture: forma B e A. Quella proposta da Watson e Crick è la forma B, quest’ultima è più stabile e contiene 10 coppie di basi per giro d’elica. La forma A ha 11 coppie di basi per giro d’elica. Il DNA a volte può formare anche un’elica sinistrorsa, si tratta della forma Z, possiede 12 coppie di basi per giro d’elica, per cui la struttura è meno spiralizzata.

Denaturazione e rinaturazione DNA

Una delle caratteristiche che rende il DNA depositario dell’informazione genetica è la sua stabilità intrinseca che ne consente la conservazione per lunghi periodi senza alterazioni. Il calore e i pH estremi causano denaturazione del DNA a doppia elica. Il processo comprende la rottura dei legami idrogeno tra le basi complementari o tramite la rottura delle interazioni idrofobiche tra le basi impilate. Come risultato la doppia elica si apre liberando le due catene singole, tuttavia i legami covalenti del DNA non vengono rotti. La denaturazione del DNA a doppia elica comporta un fenomeno detto cambiamento della densità ottica. In generale le basi azotate assorbono luce, tuttavia l’interazione con le basi impilate ha l’effetto di ridurre la luce assorbita. Questa riduzione aumenta ulteriormente quando due acidi nucleici complementari si appaiano in quanto le basi azotate vengono a trovarsi all’interno della struttura, questo effetto è detto ipocromico. La denaturazione del DNA a doppio filamento induce l’effetto opposto, cioè vi è un aumento dell’assorbimento chiamato effetto ipercromico. A tale scopo è possibile costruire un grafico mettendo in relazione la densità ottica e la temperatura. Questo grafico è detto curva di fusione, il punto medio di questa curva è la temperatura di fusione in cui i due filamenti di DNA si separano. La temperatura di fusione di ogni filamento di DNA dipende dalla quantità di accoppiamenti G-C i quali presentano tre legami idrogeno. In una molecola di DNA quindi maggiore è il numero di appaiamento G-C e maggiore è l’energia necessaria per separare i due filamenti per cui maggiore sarà la temperatura di fusione. Il DNA può essere anche rinaturato attraverso un processo rapido a una sola tappa nel caso in cui le due eliche siano ancora unite da un segmento a doppia elica di una decina o più residui. Ovvero la temperatura e il pH vengono riportati a valori fisiologici e le due catene si riavvolgono spontaneamente. Se le due catene sono completamente separate il processo avviene in due tappe: la prima è più lenta e consiste in un urto casuale delle due catene per formare un breve segmento a doppia elica, la seconda più rapida consiste in una chiusura a cerniera formando la doppia elica completa.

Ibridazione acidi nucleici

Quando una doppia elica si dissocia le sequenze di acidi nucleici possono essere valutate: in termini di somiglianza, ovvero la percentuale di basi o di coppie di basi identiche; in termini di complementarità, determinata dalle regole dell’appaiamento delle basi e può essere misurata valutando la capacità di due acidi nucleici o filamento singolo di appaiarsi. Abbiamo detto che quando un filamento di DNA viene denaturato le due catene si separano ma con molta facilità, essendo complementari, possono riformare la doppia elica, tuttavia anche le sequenze complementari appartenenti a due acidi nucleici qualsiasi possono appaiarsi tra loro con la formazione di ibridi. Questa reazione è detta ibridazione in quanto coinvolge acidi nucleici provenienti da fonti diverse. Sono stati sviluppati test per valutare la complementarità tra due filamenti i quali consistono nel mescolare due porzioni di acido nucleico e misurare la quantità di materiale a doppio filamento che si è venuto a formare. I metodi più utilizzati sono: l’ibridazione in soluzione in cui le due porzioni di DNA vengono mescolate in soluzione. Quando uno o entrambi i preparati consistono in DNA duplex, l’indagine non può essere condotta con l’ibridazione in soluzione. Questa impossibilità nasce dal fatto che, quando si denaturano due DNA duplex e poi si mescolano tra loro i preparati di filamenti singoli, possono avvenire due tipi di reazioni: possono rinaturare i filamenti singoli complementari originali, oppure ciascun filamento singolo può ibridare con una sequenza complementare dell’altro DNA. La competizione tra queste due reazioni rende, tuttavia, difficile valutare l’entità dell’ibridazione. L’ibridazione su filtro in cui le soluzioni di DNA vengono immobilizzate su filtri di nitrocellulosa cosicché non possano rinaturare. Il grado di ibridazione fra due acidi nucleici a singolo filamento può essere indice del grado di complementarità poiché due sequenze non possono perfettamente ibridare se non sono complementari, se sono strettamente correlate ma non identiche danno vita a un duplex imperfetto il cui appaiamento delle basi si interrompe a livello delle sequenze non complementari.

Superavvolgimento DNA

La doppia elica del DNA può avvolgersi su sé stessa e cambiare conformazione della molecola di DNA nello spazio. Fenomeno detto superavvolgimento, questo crea tensione nel DNA e pertanto può avvenire solo se le due estremità della molecola non sono libere o se è una molecola di DNA lineare ancorata a una struttura portante proteica. L’attorcigliamento nello stesso verso porta a un superavvolgimento positivo, aumentando le basi per giro d’elica. L’attorcigliamento nel verso opposto porta a un superavvolgimento negativo in cui ci sono meno basi per giro d’elica. Quello fisiologico nella cellula è il superavvolgimento negativo che permette alle topoisomerasi di agire. Una molecola di DNA chiusa è caratterizzata da un numero di legame, questo è dato dalla somma del numero di superavvolgimenti (W) e il numero di giri completi (T). Variazione del numero di legame come: ΔL = ΔW + ΔT.

Topoisomerasi

Enzimi coinvolti nella modificazione del grado di superavvolgimento della doppia elica. Il loro compito è quello di rimuovere i superavvolgimenti mediante rottura temporanea del singolo o del doppio filamento a cui seguono risaldature senza la formazione di estremità libere. La struttura a doppia elica fa sì che i due filamenti siano avvolti l’uno intorno all’altro per un certo numero di volte, definiti ‘numero di avvolgimento’ (T). Le molecole di DNA sono macromolecole estremamente lunghe e per occupare uno spazio compatibile con le dimensioni delle cellule batteriche e dei nuclei delle cellule eucariotiche, esso è impacchettato o condensato mediante superavvolgimenti, cioè ulteriori ripiegamenti in cui una doppia elica si avvolge su se stessa un certo numero di volte detto ‘numero di superavvolgimento’ (W). La somma T+W dà un valore detto numero di legame (L). Le topoisomerasi sono in grado di controllare il numero di legame delle molecole agendo sia sul numero di avvolgimenti che su quello di superavvolgimenti.

Classi di topoisomerasi

• Topoisomerasi I – rompe transitoriamente una sola catena del DNA facendola ruotare sull’altra rimasta integra andando ad agire sul numero di avvolgimenti aumentandolo o diminuendolo. L’energia rilasciata dalla rottura del legame fosfodiesterico viene accumulata dall’enzima e rilasciata per la formazione del nuovo legame, l’enzima non ha quindi bisogno di ATP.
• Topoisomerasi II – rompe entrambe le catene attuando due superavvolgimenti negativi. Questo enzima avvolge il DNA su se stesso, rompe entrambi i filamenti e le estremità si legano ai residui amminoacidi dell’enzima per creare un passaggio per il DNA, quindi fa passare la seconda doppia elica attraverso la rottura e risalda la rottura creata per poi dissociarsi dal DNA. Questi enzimi quindi non necessitano di energia esterna per le loro azioni ma notiamo comunque un dispendio di 2 ATP usate dalla topoisomerasi II per rigenerarsi (ricaricarsi), quindi l’idrolisi di due molecole di ATP serve per rigenerare l’enzima e non per svolgere la propria azione.

Anche nei procarioti esistono due tipi di topoisomerasi:

• DNA girasi – topoisomerasi II, introduce superavvolgimenti negativi in una molecola chiusa rilassata, la forma superavvolta ha un’energia maggiore di quella della forma rilassata e l’energia necessaria per compiere la conversione è data dall’idrolisi dell’ATP. La girasi è caratterizzata da due subunità alfa e beta (2alfa e 2beta), ogni subunità del dimero è costituita da un dominio ATPasico, da un dominio centrale contenente tirosina catalitica e un dominio C-terminale.
• Girasi inversa – topoisomerasi I, introduce superavvolgimenti positivi.

Organizzazione cromosomi

DNA lungo circa 3,3 x 10⁹ coppie di basi, quindi per entrare nella cellule e nel nucleo ha bisogno di ripiegarsi e di compattarsi su se stesso. Nei nuclei eucariotici non in divisione il materiale genetico è presente sotto forma di fibre di cromatina, quando poi la cellula si prepara a dividersi la cromatina si condensa e si organizza in cromosomi il quale numero è specie specifico. Solo il DNA sotto forma di cromosoma può essere trasmesso efficacemente alle cellule figlie.

Il primo livello di organizzazione della cromatina è rappresentato dai nucleosomi, questi sono costituiti da un core centrale di otto proteine istoniche sulle quali si avvolgono due giri di filamento di DNA. LA struttura è detta collana di perle, perché il DNA si avvolge attorno a più nucleosomi che rappresentano le perle, intervallati da DNA linker. Legato a ogni nucleosoma si trova l’istone H1 in grado di avvicinare tra loro diversi nucleosomi provocando un'ulteriore compattazione del DNA in fibre più spesse. La fibra può essere spiegata attraverso due modelli (a solenoide e a zig-zag).

• Solenoide – superelica contenente 6 nucleosomi per giro impilati l’uno sull’altro con un foro centrale, il DNA nucleosomico è esposto verso l’esterno mentre il DNA linker è immerso al centro della superelica.
• Zig-zag – presenza nucleosomi disposti appunto a zigzag, il DNA linker attraversa l’asse longitudinale della fibra.

Il DNA associato all’ottamero di istoni è detto DNA core. Nella cromatina sono presenti diversi tipi di proteine associate al DNA: gli istoni e le proteine non istoniche.

Istoni

Proteine più abbondanti associate al DNA eucariotico, sono principalmente di cinque tipi: H1, H2A, H2B, H3 e H4. Gli istoni H2A, H2B, H3 e H4 sono gli istoni del core e due copie di ciascuno vanno a formare il complesso proteico attorno al quale si avvolge DNA nucleosomico. L’istone H1 lega il DNA linker che lega due nucleosomi adiacenti. Il core nucleosomico ha una struttura discoidale che si assembla solo in presenza di DNA. La condensazione del DNA nei nucleosomi e la formazione della fibra da 30nm avviene durante l’interfase tuttavia questo grado di compattazione è ancora insufficiente quindi durante la mitosi il DNA deve essere condensato ulteriormente per poter formare i cromosomi. La fibra da 30nm quindi si ripiega a formare una struttura costituita da 6 anse disposte attorno a un’impalcatura proteica detta scaffold nucleare, nell’insieme tale struttura è definita struttura a rosetta. 30 rosette costituiscono un avvolgimento, 10 avvolgimenti costituiscono ognuno dei due cromatidi fratelli. Fanno parte dello scaffold nucleare la topoisomerasi II (tiene topologicamente le anse separate) e le proteine SMC (condensazione e mantenimento dei cromosomi).

Eterocromatina e eucromatina

La cromatina protegge dai danni chimico-fisici e regola l’espressione genica. I geni presenti sulla cromatina compattata sono silenti, cioè non possono essere trascritti a causa del legame con gli istoni e a causa di superavvolgimenti.

• Eucromatina – contiene un’elevata quantità di proteine non istoniche, altamente ripetuta, rappresenta la maggior parte del genoma e durante l’interfase appare estremamente decondensata. Durante la mitosi va incontro a una fase di condensazione. Questa è la componente della cromatina che subisce un’alternanza tra stadi di condensazione e decondensazione.
• Eterocromatina – contiene una minore quantità di proteine non istoniche, costituita da DNA altamente ripetuto che non viene mai trascritto, presente sempre in uno stato di elevata condensazione.

I geni presenti all’interno di eterocromatina sono trascrizionalmente inattivi.