Appunti Biochimica generale

Riassunto biochimica generale

Tra chimica e biochimica

Reattività di elementi e legami rimangono immutati. Le differenze (tra vivente e non) si classificano in: chimiche, fisiche e termodinamiche.

Aspetti chimici

- Selezione a livello atomico: diversi elementi predominanti tra terra e organismi viventi.

- Selettività nell'utilizzo di specie con simile reattività: meccanismi di selezione degli organismi per decidere cosa far entrare nella cellula (il calcio è molto presente nel corpo umano, ma poco nelle cellule, perché se troppo la cellula si contrae e si blocca).

- Presenza di molecole informazionali: molecole il cui ordine impartisce significato, che poi vengono organizzate secondo livelli superiori che differenziano le funzioni.

Aspetti fisici

- Compartmentalizzazione: suddivisione in compartimenti (reparti) a livello: intracellulare, cellulare e tessutale; permette il punto successivo.

- Trasporto di materiali: avviene tra i comparti.

- Signaling: trasporto di informazione per via chimica o elettrica, tra comparti, cellule e tessuti.

Aspetti termodinamici

- Sistemi viventi sono lontani dall'equilibrio: sistema in equilibrio è sostanzialmente morto, per esserci flusso di energia il sistema deve essere lontano dall'equilibrio.

- Controllo cinetico delle concentrazioni di reagenti e prodotti: in un sistema biologico "aperto" le concentrazioni dipendono dalla velocità della reazione che le produce e dalla velocità delle reazioni che lo consuma. Concentrazione dipende quindi da fattore termodinamico e fattore cinetico.

- Interconversione energia: l'energia chimica viene convertita in altre forme di energia.

Acqua

È il primo componente dei sistemi biologici ed ha 3 funzioni dal punto di vista chimico:

• Reagente (dissociazione acido, degradazione alimenti)
• Solvente (dove avvengono il 95% delle reazioni di un essere vivente)
• Agente strutturante

La molecola di acqua è fortemente asimmetrica per disposizione di atomi e di elettroni. La presenza di cariche negative e positive conferisce polarità alla molecola. L’acqua è quindi un dipolo elettrico. Le molecole d’acqua formano legame idrogeno, legame a bassa energia, che condiziona le proprietà fisiche dell'acqua. (Più è elettronegativo l’atomo che lega l’idrogeno, più sarà forte il legame; esempio H₂O e H₂S). Spesso si formano legami in modo cooperativo (la formazione di uno, dà il via agli altri). Densità massima a 4,1°C, a 0°C acqua gela, volume occupato aumenta e la densità diminuisce.

I composti sono solubili in acqua se formano legami a idrogeno con essa. Se prevalgono le interazioni solvente-soluto: solubile, se prevalgono quelle fra molecole: insolubile. Acqua è solvente anche per specie chimiche che presentano legami ionici (NaCl), con la formazione di sfere di solvatazione: idrogeni dell’acqua si rivolgono verso la carica negativa mentre l’ossigeno verso la carica positiva. Uno ione coordina molta più acqua di qualsiasi specie energetica. Aumentando il distanziamento tra gli ioni, l’effetto del campo elettrico diminuisce fino ad una soglia massima oltre la quale c’è acqua libera. Solvatazione dipende dal rapporto massa-carica.

Altra caratteristica dell’acqua è il legame idrofobico: interazione di tipo entropico che consente di minimizzare le interazioni sull’interfaccia tra un soluto apolare e l’acqua. Descrive la capacità strutturante dell’acqua dovuta alle interazioni con le molecole apolari (idrofobiche).

Metto benzene (apolare) in acqua: formazione di strutture a gabbia dette clatrati, con aumento di ordine nel sistema (diminuzione entropia). Metto una seconda molecola di benzene: si forma un clatrato unico con le molecole che si impilano (termodinamicamente favorito), il che permette di avere una superficie di contatto minore, piuttosto che avere due clatrati distinti. (Esempio di gocce di olio in brodo, poi in frigo): l’abbassamento della temperatura permette l’organizzazione.

Un altro esempio è il comportamento dell’acqua nei confronti del sapone (sale di un acido grasso a lunga catena ottenuto dopo la rottura tra glicerolo e acido grasso). I saponi sono sostanze anfifiliche, in acqua formano delle micelle: la parte polare del sapone cerca interazione con acqua mentre la parte apolare interagisce con il grasso. (Tipica struttura della membrana cellulare).

Proteine

Sono polimeri informazionali costituiti da aminoacidi, che si possono poi ripiegare nello spazio a dare strutture più complesse. Livelli di struttura: primaria, secondaria, terziaria, quaternaria. Si parla di proteine se la catena è formata da più di 30 AA, sennò si parla di peptidi e sotto i 10 AA si parla di oligopeptidi.

Aminoacidi

La maggior parte degli AA sono alfa-amminoacidi. Atomo di C centrale, detto carbonio alfa, lega sempre un H, un gruppo R che ne conferisce le caratteristiche, un gruppo amminico ed uno carbossilico. Nelle proteine sono presenti solo gli L-amminoacidi (presenza di D-amminoacidi: indice di contaminazione). Sono molecole anfoteriche, possono assumere cariche diverse in funzione del pH dell’ambiente in cui si trovano.

La volontà di perdere protone della parte amminica e quella di acquisirlo della parte carbossilica è espressa dalla costante di dissociazione acida (pKa). Il punto isoelettrico di un AA è quel valore di pH in cui l’amminoacido è privo di carica. PI = (pKa₁ + pKa₂)/2. Nella sua forma zwitterionica un AA presenta sia carica negativa che carica positiva ed è ciò che li rende delle molecole anfoteriche.

Gli AA aromatici hanno spettro caratteristico avendo molti doppi legami coniugati, assorbono tutta luce ultravioletta. (Attenzione al concetto di stato di carica in funzione del pH)

Reattività degli amminoacidi

- Legame peptidico: si forma tra il gruppo amminico di un amminoacido e il gruppo carbossilico del seguente AA formando le ordinate.

- Legame disolfuro (-S-S-): è un legame covalente che si forma tra atomi di zolfo della stessa catena. È un legame ad alta flessibilità, infatti si può parlare di scambio di disolfuri: trasformazione di un legame intramolecolare in un legame intermolecolare che unisce due molecole e che non comporta variazione del numero di -SH e -SS. Può anche riarrangiare la posizione dei legami disolfuro in una catena polipeptidica. (Può succedere tra due cisteine)

- Spesso nelle proteine ci sono amminoacidi modificati post-traduzionali, cioè dopo la sintesi della proteina e danno indicazione sulla provenienza della proteina (es -> fosfoserine delle caseine o idrossiprolina dei würstel nel collagene).

- Alcuni amminoacidi hanno funzione ormonale (tiroxina), di neurotrasmettitore (istamina) e immuno-mediatore.

Struttura delle proteine

Struttura primaria

Consiste nell’allineamento degli AA, uniti tramite legame peptidico. Le “stringhe” di AA hanno uno specifico verso di lettura: si parte dall’AA N-terminale e si finisce con l’AA C-terminale. Il legame peptidico ha parziali caratteristiche di doppio legame in virtù dell’elettronegatività dell’ossigeno e dell’ibridizzazione degli orbitali degli atomi che partecipano; si ha un solo punto di rotazione, il C-alfa degli amminoacidi. Tutto questo fa sì che la struttura venga definita a “piastre snodate”, dove il legame peptidico giace nel piano delle piastrine.

Un solo amminoacido non permette la rotazione: la prolina, che è un imminoacido, non possiede l’NH₂ libero in quanto ciclico. Se quindi in una sequenza di amminoacidi è presente una prolina, essa rappresenterà un punto di rigidità. La catena laterale di un amminoacido è responsabile anche della carica dello stesso.

Una stringa proteica è quindi condizionata da: sequenza di AA (quali e in che ordine), dal pH e dalle diverse catene laterali che sporgono. Struttura primaria consente di capire come le proteine si organizzeranno nello spazio a dare strutture più complesse con annesse funzioni. La sequenza di una proteina è determinata geneticamente, amminoacidi aggiunti uno a uno secondo l’ordine stabilito dal codice genetico.

Eventuali variazioni della sequenza incidono su: patologie, evoluzione, patogenicità e sull’utilizzo delle proteine degli alimenti (es -> diversi latti di capra per vari scopi). Le mutazioni del codice genetico possono essere:

• Conservative: introduzione di AA simile al precedente
• Semiconservative: introduzione AA diverso dal precedente

(Es -> capodoglio ha arginina invece che lisina e Alanina al posto di cisteina rispetto all’uomo, in questo modo trattiene più ossigeno e sta sotto l’acqua per anche due ore).

Proteine non sempre hanno la sequenza ipotizzata dal codice genetico per due ragioni:

• Mancato processo
• Modificazioni post-tradizionali

Es: maturazione dell’insulina (una delle prime proteine sintetizzate artificialmente). Primo prodotto di ribosomi associati a membrana è una lunga sequenza polipeptidica detta pre-pro-insulina (ancora da processare), la sequenza leader di questa catena serve per farla arrivare al pancreas dove poi viene scissa diventando pro-insulina. A questo punto c’è la creazione di disolfuri intramolecolari tra gli estremi della catena di proinsulina, con la sequenza di connessione che infine viene rimossa. Si ha così il prodotto finale detto insulina (matura), formata quindi da due catene polipeptidiche connesse mediante disolfuri.

Struttura secondaria

La catena di piastre snodate si avvolge nello spazio, stabilizzata da legami H che si formano tra CO e NH (niente a che fare con le catene laterali). Due vantaggi: meno ingombro, disposizione spaziale consente funzioni particolari. Le strutture che si possono formare sono di due tipi: alfa-elica o beta-foglietto.

Nella struttura ad alfa elica i legami si formano a distanza di 4 residui di amminoacidi (1-4, 4-8…), con precise caratteristiche: le piastrine snodate sono adagiate sulla superficie di un ipotetico cilindro, non ci sono legami all’interno del cilindro, ma solo sulla superficie. Gli NH puntano verso il basso mentre i CO verso l’alto. Dato che le proteine contengono solo L-amminoacidi, l’elica ha andamento destrorso. Le catene laterali degli AA puntano verso l’esterno del cilindro. La struttura non è semplice da stabilizzare, incompatibilità geometrica:

• La struttura non si stabilizza se c’è prolina
• No amminoacidi con cariche dello stesso segno vicine
• Residui ramificati di isoleucina e valina causano ingombro sterico
• Catena con troppe glicine non sta insieme (se in soluzione acquosa) perché la Glicina va a formare legami H con l’acqua e non più per tenere insieme CO e NH, infatti la Glicina ha come gruppo R un H che non offre la giusta protezione nei confronti del solvente

La B-lattoglobulina (BLG) appartiene alla famiglia delle calicine, è coinvolta nel trasporto di molecole idrofobiche, contiene sia regioni ad alfa-elica che regioni a beta-sheet (proteina non presente nel latte umano). Il foglietto-beta o beta-sheet è stabilizzato da legami H che si formano tra regioni della sequenza che giacciono sullo stesso piano, ma che possono essere lontani dalla sequenza, purché affiancabili. In questo modo si forma un foglietto pieghettato con le piastre amminoacidiche che giacciono su dei piani, che hanno delle angolazioni nei punti del C-alfa. I gruppi laterali sporgono dai vertici delle pieghe e proteggono i legami H dall’acqua. Anche le strutture beta-sheet sono anfifiliche e si suddividono in due tipi di foglietti:

• Filamenti paralleli (C—>N, C—>N): stesso verso, la curva di questa struttura è lunga, beta-loop
• Filamenti antiparalleli (C—>N, N—>C): verso opposto, quando si crea questo arrangiamento, la curva stretta della catena è data generalmente da un residuo di prolina, beta-turn

Le strutture beta-sheet sono strutture cooperative, la stabilità accresce all’aumentare dei filamenti/catene coinvolti. L’acquisizione di struttura secondaria può già conferire una funzione alla proteina, ad esempio la funzione di resistenza meccanica della fibroina, una proteina robusta formata da alanine e glicine, che sporgono alternate, questo permette ai due filamenti di impaccarsi (si interdigitano); in questo modo provando a forzare questa struttura si incontrerebbe una grande resistenza.

La porina è una proteina, esempio di struttura beta-sheet a formare barile-beta, struttura cava all’interno, utile per il nutrimento delle cellule. Fattori di virulenza batterici con presenza di molti loop. Malattie prioniche comportano il cambiamento della struttura secondaria della proteina.

Struttura terziaria

(stabilizzata da legami delle catene laterali) Ha come protagonisti principali le catene laterali degli AA, che possono interagire tra loro con legami chimici di forza variabile. In ordine di stabilità troviamo:

• I legami covalenti: spesso si formano tra due residui di cisteina, i quali ossidandosi formano legami disolfuro. Nella betalattoglobulina ad esempio ci sono 5 residui di cisteina, 4 dei quali impegnati nel legame disolfuro a due a due, rimane un residuo non accoppiato, la cisteina 121. Uno dei due legami è vicino alla cisteina libera che viene esposta e cerca compagno per fare reazioni: si possono avere reazioni di scambio di disolfuri (disulfide-exchange), con la formazione di disolfuro inter-proteina. Questi legami conferiscono robustezza e massima stabilità.
• I legami idrofobici: si instaurano tra catene laterali apolari e si instaurano a causa della spinta entropica dell’acqua che tende a diminuire la superficie di contatto tra essa e le regioni apolari. Queste interazioni non sono solide, ma sono importanti per definire la struttura di una proteina; quasi tutte le proteine necessitano di nascondere al loro interno i residui idrofobici e lo fanno mediamo una zona centrale detta core idrofobico. Questi legami creano regioni strutturali e funzionali sensibili allo “stato d’ordine” di acqua. La betalattoglobulina ha cavità interna rivestita di residui di AA apolari perché essa ospita molecole idrofobiche. L’albumina serica, abbondante nel plasma umano, trasporta nel sangue acidi grassi dal fegato ai tessuti; gli acidi grassi si inseriscono nel solco della proteina, il solco apolare; l’albumina è tenuta insieme da 17 ponti disolfuro + 1 cisteina libera, che servono a non far collassare la struttura.
• Legami di coordinazione con specie metalliche: è un legame robusto in cui più atomi convergono su una stessa specie chimica che di norma è un metallo. Esempi: rubredossina (atomo di ferro coordinato in modo tetraedrico da quattro SH delle cisteine a formare sorta di sacchetto), emoeritina (quattro alfa-eliche unite da due atomi di ferro, trasporta ossigeno negli invertebrati marini), ferredossina (ospita due strutture metalliche organizzate a cubo perfetto sui cui vertici si alternano atomi di ferro e zolfo), alfa-latto-albumina (struttura a sacchetto dove quattro funzioni carbossiliche sono tenute vicine da un atomo di calcio con carica positiva). Le proteine che contengono residui non organici di natura metallica sono dette proteine coniugate
• Legami ionici: si instaurano tra gruppi che portano una carica netta positiva (residui ionizzati di lisina, arginina, istidina e gruppo NH₂ terminale) e gruppi che portano una carica netta negativa (residui ionizzati di a.glutammico, a.aspartico, e gruppo COOH terminale)
• Legami H: tra gruppi donatori di H e gruppi accettori di H presenti nelle catene laterali.

Domini e strutture super-secondarie

I domini strutturali sono elementi di struttura secondaria organizzati con altri elementi di struttura secondaria; hanno una certa stabilità. Le proteine che possiedono queste strutture, hanno specifiche funzioni come:

• Proteine di funzione: RR e proteine di trasporto, se rubredossina e emeritina si organizzano in domini strutturali, ottengo rubreritina, che prende l’ossigeno e lo riduce ad acqua
• Proteine contenenti cofattori: ad esempio colesterolo ossidasi, con dominio di legame del cofattore e dominio di legame del substrato
• Proteine di deposito e con funzione meccanica: presentano domini ripetitivi, cioè caratterizzati da proteine che contengono al loro interno ripetizioni continue della stessa sequenza di AA.

Struttura quaternaria

È l’associazione permanente di più catene polipeptidiche o subunità (polimero del polimero) ciascuna con la propria struttura terziaria. Le catene polipeptidiche possono essere uguali tra loro (omopolimeri) o diverse (eteropolimeri). Non è quindi presente in tutte le proteine. I legami che la stabilizzano sono gli stessi della struttura terziaria.

Acquisizione della struttura nelle proteine: folding

Il processo che porta da polipeptide a proteina correttamente ripiegata, consente di formare strutture di ordine superiore. 2 tipi di folding:

• Folding spontaneo: la formazione degli elementi di struttura secondaria, degli eventuali domini e di una complessiva struttura terziaria è un processo spontaneo. Esperimento di Anfinsen: ha preso proteina RNasi e ne ha distrutto la struttura terziaria utilizzando degli agenti denaturanti o cautropi che rompono i legami idrofobici (urea, NH₂CONH₂, a concentrazioni molto elevate fino a 12 M in acqua). I legami disolfuri vengono rotti attraverso il tiolo generando 8 residui di cisteina.