Appunti approfonditi per esame di Biologia generale e cellulare

Il sito +1 qui è chiamato CAP (perché l'mRNA avrà lì un cappuccio) o A monte di 30 nucleotidi c'è quasi sempre la TATA box (se non c'è, il gene codifica per RNA con regione 5' non tradotta contenente regioni regolatorie) che lega i fattori basali tra cui TFIID (proteine accessorie TAF + TBP). TBP lega la TATA box e piega il DNA facilitando la trascrizione. Si legano quindi TFIIB, TFIIE, la polimerasi, TFIIF e TFIIH (hanno poca affinità quindi sono stabilizzati dal mediatore e sono in difetto rispetto al numero di geni -> competitività). La coda CTD legata al mediatore trattiene tutto finché non è fosforilata (se le sequenze regolatrici, enhancers e silencers, lo permettono) da TFIIH. Enhancers e silencers possono trovarsi migliaia di coppie lontani dalla TATA box ma siccome il DNA si conforma in solenoidi, possono essere molto vicini nello spazio. Su questi si posizionano i fattori regolatori che

hanno il dominio dilegame a queste sequenze e un dominio di transattivazione che può interagire direttamente col mediatore o reclutare co attivatori che possono anche agire sulla cromatina tramite attività acetil transferasica dell'istone H1 che si stacca se acetilato e srotola il DNA (come accade per gli ERE che reclutano il P/CAF)

RNA polimerasi III: il promotore per 5S e tRNA si trova a valle di +1 quindi i fattori di trascrizione per far partire la trascrizione dovranno staccarsi dal promotore per far passare la polimerasi. Questi fattori sono TF(III)A per 5S, B (contiene TBP) per 5S, tRNA, U6 aka coinvolti nello splicing e C per 5S e tRNA. U6 richiede anche la proteina accessoria SNAP.

Maturazione dell'mRNA:

1. Cappuccio di 7 metilguanosine (5') per: allineare l'mRNA alla subunità minore del ribosoma, comunicare alla cellula che va tradotto, stabilizzarlo, impedire alle esonucleasi di degradarlo
2. Poliadenilazione di 500-700 adenine (3')

per: durata (tanto più è lunga, tante più volteverrà tradotto -> la coda si accorcia con ogni traduzione), ha porzione di aggancio alribosoma;

a. in laboratorio si usa per separare gli mRNA da altri RNA tramite uso di oligo dT inmodo da retrotrascriverli in cDNA e creare librerie genomiche

b. regolazione dell’importo di ferro tramite recettore della transferrina: il promotoredel recettore non è molto sensibile quindi si agisce sulla coda poli A. L’mRNA delrecettore ha sito IRE che permette alle endonucleasi di tagliare la coda e quindimandare a degradare l’mRNA (se i livelli di ferro sono normali). Mancanza di ferro– il sito di taglio viene mascherato e l’mRNA tradotto

3. Splicing: gli esoni codificano per proteine, gli introni sono RNA lunghi e non codificanticon ruoli regolatori non ancora molto chiari. Le porzioni GU a 5’ di un introne indicano ilsito di splicing e all’interno dello stesso introne

c'è un'adenina accettrice. L'introne è forzato a formare un anello (legandosi all'adenina) dagli snRNA contenuti negli snRPS (complessi di proteine che legano l'RNA) che contengono sequenze complementari a 5'dell'introne, formando uno spliceosoma. Gli esoni vengono messi vicini nello spazio per essere velocemente ricuciti e a questo punto può avvenire il taglio. (splicing alternativo-> regolazione dell'espressione genica: determinazione del sesso nella drosophila: nel maschio avviene uno splicing che mantiene un codone di stop che produce proteina non funzionante, nella femmina una proteina maschera il sito di splicing e il codone di stop non viene mantenuto e la proteina è funzionante) Atrofia muscolare spinale (modulo splicing): per la sopravvivenza dei motoneuroni serve la proteina SMN1 (c'è anche SMN2 ma è alterata e degradata) che qui non viene prodotta in quantità giuste. Quindi un

oligonucleotide antisenso agisce sullo splicing diSMN2 mantenendo l'esone 7 (che prima non era prodotto e causava l'instabilità dellaproteina)⁴.

Editing: viene cambiato qualche aa per produrre proteine diverse provenienti dallostesso gene (con editing è una proteina intestinale, senza va nel fegato)⁵.

miRNA: piccoli RNA derivanti dalla regione 3' non tradotta del mRNA (le regioni dicomplementarietà formano loop tagliato da Drosha, poi uno dei due filamenti èdegradato dal Dicer) che degradano i mRNA cercando il complementare. Se tuttocombacia, si lega e proteina RISC taglia mRNA a metà, se non combacia del tutto, siattenua solo la traduzione

Esporto dell'mRNA:i mRNA sono esportati dal nucleo (tramite i pori) al citoplasma grazie alle esportine che usano la proteina accessoria Ran-GTP che sfrutta l'energia del GTP per iltrasportoalcuni RNA (come quello che codifica per l'actina) sono trasportati lungo il

citoscheletro e prodotti nei pressi delle sinapsi -> base del processo mnemonico

mRNA ha:

• regione 5’ non tradotta UTR che può assumere struttura 2° e loop (cappuccio, o regioni regolatorie, sequenze IRES che permettono di iniziare la traduzione in maniera indipendente dal cappuccio, hairpin che sono loop che possono legare proteine come quelle di trasporto)
• ORF (regione tradotta)
• 3’ UTR (poli A, regioni regolatorie come quelle che mediano il trasporto o mRNA)

Traduzione dell’mRNA:

tRNA è un RNA ripiegato in loop (porzioni complementari) che finisce in 3’ con un’adenina. Non è a trifoglio (perché non è planare) ma è un cuneo a L con 3 nucleotidi (anticodone) sulla punta e con un sito di legame con un aa in 3’ per agganciare l’aa, viene usata l’energia dell’ATP per legare AMP all’aa (amminoacil-AMP) e l’energia dell’AMP per legare l’aa al 3’ del tRNA

(amminoacil-tRNA)i codoni di stop non hanno un tRNA con anticodoni complementari→ codice genetico ridondante: 4³ codoni possibili (64) – 3 di stop = 61 (solo 20 aaò) -> molti aa sono codificati da più codoni (data più importanza a 1° e 2° nucleotide, il terzo può variare -> protezione contro mutazioni. 2 spiegazioni perchè è meno importante: alterazione chimica del 3° nucleotide durante la maturazione del tRNA; tentennamento degli acidi nucleici: i primi due combaciano perfettamente col codone, il terzo è di lato e interagisce in modo aspecifico in quanto quasi costretto a formare un legame) il frame di lettura parte dal primo AUG–> la traduzione può essere inibita tramite la fosforilazione che blocca lo scambio GTP-→ GDP Procarioti: a monte dell’AUG ci sono le sequenze Shine-Dalgarno che complementano con l’rRNA della subunità minore (che si è già abbinata ai

fattori d'inizio IF1,2,3 di cui uno contiene il GTP), permettendone il posizionamento. Si posiziona il tRNA, il GTP viene idrolizzato, si lega la subunità maggiore e inizia la sintesi. Eucarioti: il tRNA formil-metionina si posiziona e con la coda poli A sistema anche i fattori d'inizio (eIF) necessari per il posizionamento della subunità minore che si allinea grazie al cappuccio. Quando si arriva all'AUG, il complesso d'inizio si dissocia, il GTP viene idrolizzato (grazie a eIF 2) e si posiziona la subunità maggiore (con 3 siti). Il primo tRNA passa dal sito A (aa) al sito P (peptide) e arriva un altro tRNA (grazie al GTP) nel sito A, con la formazione del legame peptidico tra i due aa. La catena viene affidata al tRNA spostatosi nel sito P, mentre il primo tRNA esce dopo essersi spostato nel sito E (exit) e questo avviene fino al codone di stop grazie ai fattori di rilascio che si posizionano nel sito A. Ciclo cellulare (processo che la cellula)

segue per duplicarsi nella fase M):Si divide in interfase (G1, S, G2, visione mitosicentrica) e mitosi/meiosi G1 comprende G0, fase di quiescenza (arresto del ciclo cellulare) e punto di restrizioneMicrotubuli del fuso: astrali (si agganciano alla porzione sotto la membrana cellulare tenendo ancorati i poli); del cinetocore; polari (convergono al centro generandotensione che tiene lontana i poli)Profase: i cromosomi si condensano (preparazione alla separazione), i centrioli duplicati nella fase S iniziano a migrare ai poli opposti formando il fuso mitotico, l'instabilità deimicrotubuli aumenta e quindi si irradiano in tutte le direzioni formando un asterPrometafase: inizia con la demolizione dell'involucro e della lamina (lamina A e C si disperdono nel citoplasma, la B si lega alle vescicole membranose) a causadell'instabilità meccanica data dall'entratadei microtubuli tramite i pori. I centromerisono coperti da

proteine che fungono da punti di attacco per microtubuli (zone chiamate cinetocori). Avviene l'aggancio: ogni cromosoma è attaccato a entrambi i poli creando tensione per spostarli. Culmine: allineamento perfetto sulla piastra metafasica.

Metafase: è un punto di controllo se i cromosomi sono perfettamente allineati grazie al complesso MPF la cui degradazione è il segnale per andare in anafase. L'anafase inizia con la degradazione delle coesine che tengono insieme i cromatidi fratelli.

Anafase: i cromatidi fratelli iniziano a separarsi, le fibre del citoscheletro sono addensate ai poli e i cromosomi iniziano a scivolare lungo i microtubuli fino ai poli (grazie alla depolimerizzazione dei microtubuli). I poli si allontanano (contribuendo alla segregazione dei cromosomi) grazie alle chinesine e dineine.

Telofase: il fuso mitotico si disgrega, le vescicole si associano ai cromosomi formando due nuclei. Inizia a crearsi un anello contrattile tramite lo

Scivolamento dell'actina sull'amiosina che porta alla divisione fisica delle due cellule nella citochinesi.

Differenze mitosi/meiosi:

La mitosi è attraversata dalle cellule somatiche, la meiosi dalle cellule germinali nei testicoli e ovaie con funzione di produrre i gameti (4 cellule aploidi).

Ci sono due fasi: meiosi I e II. Nella meiosi I il cromosoma duplicato paterno cerca tramite regioni di omologia il cromosoma duplicato materno formando una tetrade o complesso sinaptonemico.

Nell'anafase I non si separano i cromatidi fratelli ma i due omologhi (cromosoma duplicato paterno si separa dal cromosoma duplicato materno).

La cellula è tratta in inganno: il DNA alla fine di meiosi I ha l'aspetto del DNA uscito dalla fase S e questo consente una nuova divisione.

Profase I (scopo: formare la tetrade e fare il crossing over):

• Leptotene: gli omologhi materno e paterno si cercano per complementarietà.
• Zigotene: i punti di omologia si legano.

Formando una sinapsi e la tetrade sio allinea