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Biologia: struttura del DNA

Introduzione

Le istruzioni della cellula sono contenute nel genoma, che è la somma di tutte le molecole di DNA contenute nella cellula (l’informazione biologica è scritta nel linguaggio genetico comune a tutti gli organismi).

Sequenza nucleotidica

Differiscono tra loro per la sequenza delle basi azotate. La sequenza nucleotidica contiene l’informazione genetica. I geni contengono l’informazione che la cellula usa per sintetizzare le proteine. Le proteine costituiscono gran parte della struttura dell’organismo, delle cellule e controllano la maggior parte delle reazioni chimiche nelle cellule.

Caratteristiche del materiale genetico

• Deve dare informazioni per il fenotipo: espressione delle proteine, nella sequenza dei geni del DNA deve essere scritto il codice che determina la sequenza degli amminoacidi delle proteine.
• Deve essere trasmesso: da una cellula madre a una cellula figlia, deve potersi duplicare senza errori per mantenere costanti le caratteristiche della cellula e della specie.
• Deve essere chimicamente stabile: per non variare nel tempo.
• Deve avere la capacità di evolversi: subire mutazioni e mantenere questi cambiamenti in maniera stabile. Con la genomica moderna è risultato che il DNA muta tantissimo (non sempre patologicamente). Questa capacità spiega la diversità tra le specie e l’evoluzione delle specie nel tempo.

Composizione chimica del DNA

È un polimero di nucleotidi:

• Zucchero a 5 atomi di carbonio (2-desossiribosio).
• Gruppo fosfato.
• Base azotata: adenina, guanina (purine, 2 anelli) / citosina, timina (pirimidina, 1 anello).

Il 2-desossiribosio è zucchero a 5 atomi di carbonio che manca di un gruppo ossidrile in posizione 2. È in forma chiusa, cioè c’è un legame tra il C1 e il C4, il C5 rimane quindi fuori dall’anello. Gli atomi importanti sono il C1 dove si lega una delle 4 basi e il C5 dove si lega H₃PO₄.

Quattro tipi di nucleotidi: AMP, TMP, GMP, CMP. I nucleotidi nel DNA si legano tramite H₃PO₄ che fa da ponte tra C3 dello zucchero di un nucleotide e C5 dello zucchero del nucleotide successivo. Tutte le catene di DNA hanno una polarità (5 o 3), una direzione, un’estremità libera al 5 e al 3. Le due catene sono antiparallele. Le basi sono sempre legate purina-pirimidina. Le basi sono legate tra loro tramite legami a idrogeno (2 tra AT e 3 tra CG).

Struttura del DNA

Due filamenti di DNA antiparalleli si avvolgono a formare una struttura ad alpha elica lievemente destrorsa, le basi non sono perpendicolari all’asse dell’elica ma creano un solco minore e un solco maggiore che si alternano. Lo scheletro di questa elica è costituito dallo zucchero pentoso e dall’H₃PO₄. Nei solchi le proteine interagiscono con il DNA.

Il diametro dell’alpha elica è di 20 Å (1Å = 10^-8 cm). 10 paia di basi definiscono il passo dell’elica, lungo l’elica ci sono 10 paia di basi ogni 34 Å. Il DNA intero è lungo circa 2m, per rientrare all’interno della cellula si organizza in nucleosomi (dove il DNA interagisce con le proteine istoniche), i quali si compattano a formare nucleosomi impaccati e fanno sì che la cromatina raggiunga un grado di compattamento tale da rientrare all’interno del nucleo delle cellule. Massimo stadio di condensazione durante la metafase della divisione cellulare.

Il DNA eucariotico è sempre complessato con delle proteine istoniche.

Replicazione del DNA (fase S)

L’informazione data dalla sequenza dei nucleotidi complementari permette di replicare le due eliche ottenendo le due doppie eliche uguali a quella d’origine, prima che questo avvenga il DNA deve raddoppiare se stesso durante la replicazione. Prima della divisione, il DNA si duplica in maniera semiconservativa in modo che ogni cellula figlia riceva un filamento della cellula madre e un filamento di nuova sintesi.

I nuovi filamenti di DNA vengono sintetizzati copiando i filamenti stampo secondo la legge della complementarità, l’allungamento avviene SEMPRE in direzione 5-3. L’enzima DNA-polimerasi lega all’OH del C3 dello zucchero dell’ultimo nucleotide l’acido fosforico legato al C5 del successivo nucleotide (legame fosfodiesterico). La DNA polimerasi utilizza dei nucleotidi trifosfati per ricavare l’energia necessaria per creare il legame fosfodiesterico. La DNA polimerasi è l’enzima chiave perché realizza la duplicazione in quanto sceglie le basi da inserire in logica alla complementarità.

Principali enzimi e fattori della replicazione del DNA (nei procarioti)

• Elicasi: apre la doppia elica del DNA, si incunea fra i due filamenti stampo nella forcella di replicazione.
• SSB proteins (single-strand binding proteins): tengono aperte le due eliche per evitare che si richiuda.
• DNA topoisomerasi: proteine che eliminano i superavvolgimenti del DNA.
• Primasi: sintetizza l’innesco di RNA, piccolo frammento che viene sintetizzato come nuovo frammento di DNA (complementare e antiparallelo), che dà l’estremità 3' primo alla quale la polimerasi può legarsi.
• DNA polimerasi: non è in grado di iniziare la sintesi ex-novo, ma può solo aggiungere nucleotidi ad un innesco già preparato (primer prodotto dalla primasi).
• DNA ligasi: salda tra loro i frammenti di Okazaki, frammenti di DNA discontinui.

Origine di replicazione

Una nei procarioti, di più negli eucarioti. L’elicasi riconosce questa frequenza e si attacca. Filamento guida: continua e procederà nella direzione di apertura della forcella di replicazione. Filamento lento: avverrà a tratti discontinui e procederà in direzione opposta all’apertura della forcella di replicazione (frammenti di Okazaki). Sono presenti diversi inneschi utilizzati dalla DNA polimerasi. La ligasi legherà insieme i tratti di DNA.

Una volta che il DNA viene replicato, i primer vengono eliminati dalle attività di taglio di un altro tipo di DNA-polimerasi (esonucleasi). Si pensa che ci sia un’unica DNA polimerasi che agisce con due bracci (uno sul filamento guida e uno sul filamento lento), le “due” DNA polimerasi procedono insieme ma copiano due sequenze differenti.

Replicazione bidirezionale

La forca replicativa è la regione di DNA compresa tra la doppia elica parentale che si sta aprendo e le due nuove eliche. Le unità di replicazione (repliconi) possono essere uni o bi-direzionali a seconda che all’origine si siano formate 1 o 2 forche replicative. Il filamento guida e il filamento lento quindi dipendono dalla direzione di apertura della forcella di replicazione.

Replicazione negli eucarioti e procarioti

La replicazione negli eucarioti avviene a partire da molti punti lungo il cromosoma (asincrona perché non inizia tutta nello stesso momento ma ci sono diverse origini di replicazione che si attivano in momenti differenti, ciascuna ha una propria origine e due forche replicative che si muovono in direzioni opposte). La replicazione nei procarioti avviene con un’origine di replicazione (sincrona).

Differenze nella replicazione tra procarioti ed eucarioti

• Procarioti: non hanno il nucleo, DNA circolare, DNA-polimerasi III, una bolla di replicazione, 2 forcelle di replicazione (bidirezionale).
• Eucarioti: hanno il nucleo, il DNA è lineare, DNA-polimerasi alfa e delta, molte bolle di replicazione, 2 forcelle di replicazione (bidirezionale).

Telomerasi

Una volta rimossi gli inneschi alla fine dei cromosomi, se non ci fosse un sistema di telomeri (parte terminale dei cromosomi), di generazione in generazione si accorcerebbe sempre di più il DNA e si avrebbe l’estinzione. Le telomerasi replicano e conservano i telomeri. Con l’avanzare dell’età le telomerasi perdono la loro funzione e i cromosomi si accorciano, segnando come una linea del tempo. Nelle cellule tumorali riattivano l’azione delle telomerasi, motivo per cui queste cellule sono considerate immortali.

I telomeri non contengono geni, sono sequenze ripetute tipiche di ogni specie. Esistono delle polimerasi specializzate in grado di allungare il filamento che rimane già più lungo, queste sequenze ripetute del telomero sono copiate dall’RNA nell’enzima tramite la trascrizione inversa (protegge dalla degradazione dei telomeri).

Trascrizione dell'RNA

Ci sono molti RNA che non codificano per le proteine (es. micro RNA), molti partecipano alla traduzione delle proteine o agiscono sulla regolazione dei geni. Dopo aver sequenziato il genoma umano si è scoperto che il numero di geni è molto elevato (20/25 mila geni), si è capito che la parte codificante del nostro genoma è minoritaria e ci sono molte frequenze di regolazione. Alla base di tutto ciò è presente il meccanismo della trascrizione, molto selettivo.

RNA a singolo filamento: la trascrizione che riguarda una parte del nostro DNA produce un RNA a singolo filamento. Dogma centrale delle biologia molecolare: DNA (nucleotidi) – RNA (nucleotidi) – PROTEINE (aminoacidi). È la traduzione a rendere utilizzabile l’informazione codificata dall’RNA, ci sarà una conversione del codice genetico, da un’informazione codificata in nucleotidi ad una in aminoacidi.

Confronto DNA/RNA

• 1 filamento
• Zucchero: ribosio
• Uracile al posto della timina

Tipi di RNA

• mRNA: solo qui si decodifica l’informazione
• tRNA: trasportano gli aminoacidi specifici per costituire la proteina
• rRNA: insieme alle proteine ribosomiali costituiscono i ribosomi nei quali vengono sintetizzate le proteine

Trascrizione e traduzione

La trascrizione e la traduzione nei procarioti sono contemporanee (nel citoplasma) in quanto non c’è la distinzione nucleo-citoplasma. Negli eucarioti l’RNA deve subire modificazioni prima di essere utilizzato nel citoplasma per la sintesi proteica.

Dettagli sulla trascrizione

È una reazione di polimerizzazione per mezzo della quale vengono sintetizzati RNA. La sintesi avviene in direzione 5-3. Gli RNA vengono sintetizzati copiando un singolo filamento di DNA (di senso) secondo la legge della complementarità. Quindi il filamento di RNA sarà complementare e antiparallelo al filamento di senso e uguale al filamento di non senso. Vengono utilizzati nucleotidi trifosfati per fornire energia (ATP, UTP, CTP, GTP). L’enzima che sintetizza RNA è la RNA-polimerasi capace di iniziare la sintesi del primo nucleotide: non necessita dell’innesco (primer). La trascrizione inizia con una bolla di trascrizione, la trascrizione avviene il 5-3.

Trascrizione nei procarioti

È presente una sola RNA-polimerasi per mRNA, tRNA, rRNA (si misurano in unità Svedberg; tengono conto della densità e della velocità di sedimentazione durante la centrifugazione poiché non è possibile determinare l’alto numero di nucleotidi). La RNA-polimerasi è composta da: un core, parte attiva che fa la trascrizione, (costituito da 2alpha, beta, beta primo) e subunità sigma (posizione l’RNA polimerasi in maniera corretta perché possa iniziare la trascrizione. A monte della zona che dovrà essere trascritta esiste una zona di regolazione per il preciso e corretto attacco dell’RNA polimerasi: promotore (zona riconosciuta da sigma che si posizione a fa sì che la RNA-polimerasi apra la bolla di trascrizione e trascriva, il promotore non viene trascritto). Le sequenze del promotore vengono numerate con numeri negativi, i numeri positivi iniziano quando si trascrivono i nucleotidi.

Inizio della trascrizione

La subunità sigma si lega al core ed esplora il DNA sino a trovare una sequenza a -35nt dal sito di inizio della trascrizione e successivamente una sequenza a -10nt (pribnow box) dal sito di inizio della trascrizione, alla quale si lega. Una volta legata induce il DNA a srotolarsi aprendo la bolla di trascrizione e posizionando il core in modo preciso.