Antropologia

APPLICAZIONI CROMOSOMA Y:

- ANALISI FORESE

- ANALISI GENEALOGICO

- STUDIO EVUZIONISTICO

Con l’utilizzo dell’STR maschile è possibile andare a recuperare il DNA maschile e

differenziarlo dal DNA femminile a livello degli STR in quanto sono presenti solo sul

maschio. → →

Essendo un marcatore unilineare si osserva un picco perché è in fase aploide

se ci sono delle piccole mutazioni non è possibile

accusare una persona se il suo cromosoma Y

presenta delle differenze rispetto a quelle trovate

sulla scena del crimine.

per capire se questo STR è discriminante

devo vedere la frequenza nella

→

popolazione se tutti gli individui hanno

la stessa variabilità per quel determinato

STR non è discriminante.

LOCALIZZAZIONE STR SUL CROMOSOMA Y

Tutto il braccio p e parte del q

Per capire che probabilità c’è, dato un individuo con

quel deteminato STR, che quell’STR sia = ad un altro per effetto del caso oppure è

proprio il ricercato e lo si dice in base a quanto è frequente.

→

Se la frequenza è alta il potere discriminatorio è basso

→

Se la frequenza è bassissima potere discriminatorio è alto.

Slcuni STR amplificano frammenti molto grandi, ma siccome non sempre si lavora con

→sono →che

DNA ben conservato stati anche realizzati i mini-STR amplificano piccoli

frammenti STR, in modo da essere utilizzano in contesti di DNA altamente degradato.

PROGETTO LEONARDO

È uno studio di carattere antropologico che riguarda la genealogia di Leonardo da Vinci:

voleva verificare se le ossa conservate nella cripta in Francia appartenevano a Leonard o

ALBERO GENEALOGICO DEL CROMOSOMA Y:

possiamo fare la genealogia sugli SNP o sugli STR

dell’Y.

Avere gli Y dei maschi dell’ultima generazione, dei

discedenti di Leonardo da Vinci, se sono tutti uguali tra

→ significa avere l’Y di Leonardo da Vinci

di loro

Per realizzare questo progetto occorre andare a ricercare i discendenti attuali e occorre

andare a trovare DNA antico da tombe in cui sappiamo essere sepolti discendenti ai

→

tempi di leonardo campiono sia gli uni e sia gli altri.

Fare analisi sul cromosoma Y di un individuo attuale (fare la PCR), è molto semplice,

mentre su quelli vissuti nel passato occorre un approccio NGS + tarhet enrichiment

capture→ sono state sviluppate sonde per catturare tutto il cromosoma Y per catturare ca

→Sequenziamento

79 mila SNP con 41,145 sonde (simile alla tecnica Marecic)

attraverso il MAPPING della sequenza del cromosoma Y come riferimento : per fare

analisi su persone che sono oggi in vita, e sulle persone che non sono piu in vita per

→In

confrontare le sequenze del cromosoma Y questo modo se si osserva la stessa

sequenza su genealogia differenti attraverso la conoscenza del tipo di ereditarietà di

→

questo cromosoma saremo in grado di ricostruire il cromosoma Y di Leonardo.

A questo punto si può verificare se le reliquie hanno lo stesso cromosoma Y di leonardo

→ →

se è la stessa sequenza è stato dimostrato e si può analizzare il genoma completo

STR su campioni antichi: dove e come possiamo fare gli STR su campioni

degradati.

Il DNA viene estratto da rocche petrose: in questo modo restituisce ben conservato:

studio condotto su 13 individui longobardi di cui si sapevano le relazioni parentali, datati

dal 6 al 7 secolo C.E (dopo cristo) e sono stati testati attraverso gli STR.

Su un campione antico, andando ad estrarre DNA dal dente o dal femore il numero di

loci che si riesce ad utilizzare è nullo o inferiore rispetto alla rocca petrosa.

(risenti)

*possiamo fare relazioni parentali s campioni antichi non utilizzando STR quando n on

abbiamo rocche petrose ma utulizzando SNPs LEZIONE 2 DICEMBRE

ANALISI BIOINFORMATICA SU DNA ANTICO

Ci permettono di poter discriminare tra un DNA endogeno ed esogeno

Ci sono vari tipi di macchine che sequenziano il DNA: miniSEQ e Iseq (NovaSEQ

→

versione aggiornata di hiSEQ che permette di leggere fino a 60 genomi umani )

1) preparazione libreria 2) Bridge PCR: perché le molecole si posizionano a ponte, si

forma il cluster, cioè un insieme di molecole clonali tutte identiche l’una con l’altra

3) Sequenziamento: sequenziamento si svolge a partire da un vetrino: noi utilizzeremo il

sequenziamento su piattaforma ILLUMINA -> per questo tipo di sequenziamento si

utilizza un vetrino chiamato FLOW-CELL: è proprio come un vetrino da microscopio

ed è la piattaforma su cui avvengono tutte e reazioni necessarie allo svolgimento del

sequenziamento. La FLOW-CELL, a seconda del modello di sequenziatore che si usa,

Quindi l’alternativa non è

può essere: divisa in tanti sotto-canalini chiamati LANE. un

vetrino suddiviso, ma è un vetrino liscio e unico. Queste sotto divisioni si chiamano

LANE e una lane a sua volta è suddivisa in altre sotto regioni che si chiamano TILE: il

tile altro non è che una regione di spazio dove sono ancorati dei primer di

sequenziamento complementari agli adattatori che abbiamo attaccato alle sequenze e

sono quelli che danno l’avvio sia alla bridge PCR, sia al sequenziamento vero e proprio.

Il TILE inoltre è anche quella piccolissima regione di spazio in cui viene rilevata

l’immagine perché durante l’avvio del sequenziamento si ha il

dall CCD CAMERA:

rilascio di picchi luminosi in base al tipo di fluoroforo e quindi in base al nucleotide che

viene incorporato e questo picco luminoso viene rilevato da una foto. Il tile è il

pezzettino che di volta in volta viene fotografato e scansionato. Ovviamente, come per le

foto, maggiore è il numero di TILE e migliore sarà la risoluzione dell’immagine, per cui

più accurato sarà il sequenziamento.

Le lane inoltre possono essere costituite o da 13 o da 19 TILE: di solito quello che

utilizziamo è quella da 19 tile in modo tale da avere un’altissima risoluzione

dell’immagine e quindi un’ottima lettura.

COME AVVIENE IL SEQUENZIAMENTO?

È un sequenziamento che avviene per sintesi utilizzando 4 nucleotidi, ciascuno dei quali

è marcato con un fluoroforo di colore diverso; questi nucleotidi, avendo il fluoroforo,

una volta incorporati bloccano la sintesi, per cui quando mando il primo ciclo si

attaccano i fluorofori alla regione corrispondente, ma poi la sintesi non può procedere

perché il fluoroforo legato impedisce l’attacco del nucleotide successivo. Per cui faccio

partire il primo ciclo, si attaccano i nucleotidi alla base corrispondente e a questo punto

viene identificato dalla CCD camera l’immagine, viene cioè fatta una foto

dell’immagine e successivamente viene associato a ciascun colore, la base

corrispondente. Il sequenziamento inoltre può essere di 2 tipi divers

SINGLE-END

SEQUENCING viene usato

per sequenziare genomi attuali.

PAIRED-END

SEQUENCING viene fatto

quando abbiamo a che fare su

campioni di DNA degradato

Vengono descritti nel sequenziatore anche i dati per ciclo, i dati per LANE, altri risultati come

Qscore distribution (numero di reads che vengono lette) e la superficie dove que sto avviene.

È importante anche la densità di cluster →

- underclustered: poche generazioni di sequenziamento su un cluster da poche

informazioni

- Optimal clustering: in cui il cluster in cui avviene il sequenziamento non è molto

→

affollato da read lettura ottimale non riusciamo a distinguere una read dall’altra.

→

- Overclustered: ci sono molte read

La densità di cluster dipende dal pool di libreria caricata.

Flusso di lavoro su DNA degradato da campioni antichi

Quindi in base alla tipologia di studi

che vogliamo fare, si utilizza un

sequenziamento piuttosto che un altro.

Per l’analisi sul genoma mitocondriale,

visto che è piccolo, si utilizza il MY SEC

perché grazie alle sue 25 milioni di reads

generate, è più che sufficiente per ottenere

le letture relative ai mitocondri. Se invece

si deve mappare il nucleare si utilizza o il

MY SEC o l’HIGH SEC perché sul

nucleare abbiamo bisogno di una →

maggiore potenza di sequenziamento *Novaseq e Hiseq hanno un output piu elevato

perciò lo si usa per capture nu

Determinazione biologica del sesso lo si fa quando:

campioni infanti o subalduti, anche se c’è il bacino.

-

- manca parti anatomiche come il bacino negli adulti.

l’avvento delle NGS la situazione si è complicata: prima di tutto perché devo

Con gestire

una gigantesca mole di dati che non è più una sola lettura per ciascun campione, ma

sono migliaia di letture per ciascun campione e ci sono numerosi campioni per LANE

(grazie agli indici che ci permette di distinguere una libreria da un’altra). Quindi la

primissima fase, indispensabile prima di iniziare la ricostruzione del frammento è:

EFFETTUARE IL DE-MULTIPLEXING è un attività di carattere bioinformatico

che separa i vari campioni attraverso la lettura degli indici -->viene letto il nome del

campione e gli indici associati a questo campione, per cui, facendo questa associazione,

NOME DEL CAMPIONE-INDICI, lui riesce ad associarmi a ciascuncampione le reads

che si trovano all’interno dello

che portano quegli indici→ viene fatta da due software

strumento, quindi questa parte qui la fa ancora il sequenziatore. I software che il

sequenziatore utilizza sono CASABA e, quello che si chiama il REPORTER

SOFTWARE (nel caso del My Seq) e blc2fastq.pl

Lo strumento fa le varie associazioni e crea dei file: sono file OUTPUT in formato

FAST-Q: file di testo dove vengono separate le reads che hanno tra loro indice ugule.

Ho anche bisogno del SIMPLE SHEET: ha un formato EXCEL, è una tabella in cui

nella prima parte ci sono le informazioni legate agli esperimenti che stiamo facendo, per

cui c’è il nome dell’operatore, il progetto, la data di sequenziamento ecc. poi c’è una

sezione in cui è riportata l’informazione legata alle reads, cioè alle letture che voglio

ottenere; per cui ci sono scritti il numero dei cicli utilizzati e il numero degli indici, cioè

2, e gli indici per ogni campioni.

Per i campioni antichi si fa il sequenziamento PAIRED-END: Per ciascun campione

in forward e l’altro è

ottengo due file: uno è quello dove sono elencate tutte le sequenze

quello dove ci sono tutte le sequenze in reverse e sono quelle che si chiamano R1 e R2,

Una volta ottenuti questi file li devo trattare in modo tale che alla fine possa ricostruire

solo ed esclusivamente la sequenza consenso del campione

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