Analisi dei medicinali II

ANALISI DEI MEDICINALI II - INTRODUZIONE

La chimica analitica è una scienza che si basa su una misura. Attraverso la chimica analitica

possiamo separare, identificare e determinare le quantità relative dei componenti (analiti) presenti

in un campione di sostanza.

Si divide in due grandi branche:

• Analisi quantitativa: stabilisce la quantità di uno o più componenti presenti nel campione;

• Analisi qualitativa: rivela l’identità chimica di uno o più componenti presenti nel campione

(riconoscimento in laboratorio).

I principali campi di applicazione della chimica analitica sono le analisi dei medicinali e le analisi

tossicologiche.

Le analisi dei medicinali vengono condotte su:

− Prodotto finito (per prodotto finito intendiamo il principio attivo più tutti i componenti che

costituiscono la sua formulazione);

− Materie prime;

− Processi di produzione (il cosiddetto controllo qualità, è un insieme di procedure, cioè di

attivita’ ed interventi, atte a stabilire che un lotto di produzione sia conforme a determinate

specifiche; il lotto è tutto quel medicinale che viene prodotto in un dato ciclo di produzione,

quindi la sua caratteristica principale è la sua omogeneita’).

Le analisi tossicologiche comprendono (non sono nostro argomento di lezione):

− Tossicologia clinica: ricerca farmaci o metaboliti nei fluidi biologici

− Tossicologia forense: serve ad identificare sostanze biologicamente o farmacologicamente

attive collegate a fatti che possono essere colposi, dolosi (come possono essere i veleni, gli

stupefacenti, sostanze dopanti).

In conclusione, l’analisi dei medicinali serve a verificare la qualità del medicinale, che deriva dalle

seguenti 3 caratteristiche:

− Efficacia: agisce come atteso, producendo l’effetto desiderato;

− Sicurezza: prodotti ottenuti secondo metodiche costanti, controllate ed esenti da ogni

pericolo;

− Purezza: prodotti esenti da qualsivoglia contaminazione. Questo non significa che il

medicinale deve essere puro al 100%, ma che le impurezze sono presenti non oltre i limiti

stabiliti.

La qualità del medicinale è accertata attraverso le analisi sia sul prodotto finito e sia sulle materie

prime utilizzate per la sua produzione.

Per verificarne la qualità utilizziamo sia analisi qualitative che analisi quantitative: mediante l’analisi

qualitativa identifichiamo i singoli componenti del medicinale e le eventuali impurezze; l’analisi

quantitativa serve a determinare la quantità di uno più componenti del nostro medicinale (con

determinare si intende identificare il dosaggio).

Le analisi servono a verificare la corrispondenza delle caratteristiche analitiche delle sostanze

impiegate (del nostro medicinale) alle rispettive specifiche.

Per specifiche si intendono le procedure analitiche che definiscono le caratteristiche della sostanza:

− da un punto di vista qualitativo (mediante l’identificazione); 1

− da un punto di vista quantitativo (mediante l’indicazione del contenuto del principio attivo e

dei limiti delle impurezze).

Si definisce impurezza ogni componente di una sostanza per uso farmaceutico che non è l’entità

chimica definita come sostanza (definizione farmacopea).

Una sostanza non sara’ mai pura al 100%, ma ci saranno inevitabilmente delle impurezze che la

accompagnano.

Le impurezze possono essere:

− Già presenti nel prodotto finito (derivanti dal processo di produzione);

− Formarsi durante la vita del prodotto farmaceutico (shelf life).

Le impurezze possono essere accompagnate o derivare dal:

• Principio attivo (perché il principio attivo è una molecola complessa che può avere dei gruppi

funzionali reattivi che portano il principio attivo a degradarsi, perché danno luogo a instabilita’

chimica; inoltre il principio attivo è anche il componente principale in quantità in peso nella

formulazione del nostro medicinale) ed è ottenuto per:

− Sintesi organica;

− Via estrattiva;

− Semisintesi (un prodotto estratto di origine naturale è poi opportunamente modificato

per via chimica al fine di ottenere dei p.a. migliori in termini di potenza, stabilita’,

tossicita’, ecc).

• Ingredienti inerti (additivi o eccipienti): è raro che producano impuerzze, perché vengono scelti

apposta per la loro stabilita’.

Un esempio di principio attivo prodotto per sintesi è l’acetilcisteina, un mucolitico (prodotto di

sintesi). Le impurezze che l’accompagnano sono L- cisteina, L-cistina, la (N,S) diacetil L- cisteina, e la

N-N’ diacetil L-cistina L-cisteina va a reagire con l’anidride acetica in

presenza di acetato di sodio e come prodotto

principale otteniamo acetilcisteina. Può accadere

che l’acetilazione avvenga anche sul gruppo SH in

modo da ottenere la (N-S) diacetil-L-cisteina. L’L-

cistina è un’impurezza di per sé sempre presente e

anch’essa può subire il processo di acetilazione

così da avere la N-N’ diacetil L-cistina. Inoltre, il

solvente stesso, l’anidride acetica, libera acetile

per idrolisi.

Le impurezze presenti quindi derivano dal suo

processo sintetico, dall’instabilità dei reattivi,

residui di solventi e dai sottoprodotti di reazione.

Un altro esempio è dato dalla morfina, analgesico

narcotico (prodotto ottenuto per estrazione dal

papavero da oppio).

Le impurezze che l’accompagnano sono: morfina-

N-ossido o codeina che, avendo delle

caratteristiche molto simili alla morfina, vengono

co-estratti. 2

Le impurezze attese sono:

- Residui di reattivi*

- Prodotti secondari*

- Prodotti co-estratti*

- Residui di solventi

- Materiali impiegati per la costruzione o pulizia degli impianti

Le impurezze correlate sono i residui dei reattivi, i prodotti secondari di sintesi e i prodotti co-

estratti. Sono definite correlate le impurezze, derivanti dai processi di preparazione, che

generalmente accompagnando l’entità chimica definita come sostanza. Di solito, le impurezze

correlate vengono rilevate e valutate mediante metodi cromatografici (TLC) e devono essere

presenti al di sotto di una certa soglia.

Otteniamo quindi oltre che il prodotto principale che è il principio attivo anche altre macchiette più

piccole che sono le impurezze che lo accompagnano. Dopo di che c’e il saggio che deve accertare

che le eventuali impurezze presenti nel campione rispetto al principio attivo siano al di sotto di una

certa soglia, di un certo limite.

Alle impurezze correlate si applicano le soglie di identificazione e qualificazione:

• Soglia di identificazione: limite oltre il quale l’impurezza deve essere identificata (>0.2%) .

L’impurezza identificata è un’impurezza strutturalmente caratterizzata.

• Soglia di qualificazione: limite oltre il quale l’impurezza deve essere qualificata (>0.1%).

L’impurezza qualificata è un’impurezza per la quale è stata stabilita una soglia di sicurezza

biologica, tenendo conto della massima dose giornaliera del farmaco.

Se la dose pro die è inferiore ai 2 grammi la soglia di qualificazione è 0.1%, se la dose giornaliera

è superiore ai 2 grammi la soglia di qualificazione scende allo 0.05%.

Le impurezze possono formarsi anche dopo la preparazione del prodotto, durante la vita del

medicinale, cioè quando è gia’ nella sua formulazione. Comprendono:

Prodotto di degradazione

- Temperatura

- Ph

- Umidità

- Luce

- Prodotti di interazione (farmaco/eccipienti/additivi/solventi residui/contenitore)

-

Per poter predire questo tipo di prodotti di degradazione vengono effettuati degli studi potendo

cosi fornire la durata della vita del farmaco (scadenza), le indicazioni di conservazione

(immagazzinamento/stoccaggio/temperatura/lontano dalla luce, ecc), e anche mettere a punto

l’opportuna formulazione del principio attivo (eccipienti adatti).

STUDI DI DEGRADAZIONE

Un prodotto di degradazione o di decomposizione è un cambiamento chimico nella molecola di un

farmaco prodottosi nel tempo e/o per azione della luce, temperatura, ph, umidità o per reazione

con un eccipiente e/o per contatto con il contenitore o con il tappo.

Vengono condotti sottoponendo sia il principio attivo che il medicinale in toto a delle condizioni

accettabili o verosimili. Vengono condotti in maniera RAGIONEVOLE, cioè si utilizzano delle

situazioni che si possono verificare durante la vita del farmaco; vengono condotti affinché si formi

un 10-20% di prodotto di degradazione (se il prodotto di degradazione è >20% significa che si sta 3

stressando troppo il medicinale e ciò non si verifica mai).

Questi prodotti vengono poi separati attraverso hplc e identificati attraverso MNR, Massa.

Gli studi di degradazione comprendono:

Idrolisi acido/basica

- Stess termico, anche in presenza di umidità

- Ossidazione

- Esposizione alla luce

-

Studi di stabilità in ambiente acido/basico

Si effettua su quei princpi attivi che hanno gruppi funzionali sensibili (tutto ciò che può essere

idrolizzato o che è sensibile al ph), come esteri, ammidi, carbammati, centri CHIRALI epimerizzabili,

ecc.

Il p.a. viene sciolto in soluzioni di acido cloridrico o idrossido di sodio ad una concentrazione 1N.

dopo aver stabilito qqueste condizioni, l’idrolisi viene condotta in acido debole o base debole

(ac.acetico/ammoniaca) 1N con una concentrazione 1mg/ml (con eventuali co-solventi nel caso sia

insolubile). L’idrolisi viene condotta dapprima a temperatura ambiente e poi viene innalzata fino a

70 gradi; il tempo massimo di idrolisi è di una settimana.

In seguito, si vanno ad identificare e a dosare i prodotti di degradazione ottenuti.

Stress termico

Lo stress termico serve a valutare la validita’ e la

scadenza del nostro principio. Il nostro principio

attivo e il medicinale in toto vengono sottoposti a

temperature sempre più alte, la velocità di

degradazione aumenta e per innalzamento della

temperatura di 10 gradi, il tempo di

immagazzinamento si dimezza.

Lo stress termico mima lo scorrere del tempo:

poiche’ non si può osservare a lungo termine la

stabilita’ del medicinale se ne forza la degradazione,

aumentando la temperatura.

Studi di ossidazione

Permettono di capire cosa succede se il prodotto viene esposto all’aria. Si sottopongono quei

principi attivi che hanno gruppi funzionali sensibili come eteroatomi (S,N), aldeidi, alcoli I e II.

L’agente ossidante è 02 (si preferisce all’acqua ossigenata perché quest’ultima da’ problemi

secondari che portano a risultati non predittivi).

La reazione viene condotta in reattori, in siloni, ad una pressione tra 3 e 20 atm. La reazione di

ossidazione viene arrestata con degli antiossidanti, come ad esempio l’acido ascorbico.

Studi di fotosensibilità

Permettono di stabilire la stabilita’all’esposizione alla luce e sono sottoposte molecole aventi gruppi

funzionali sensibili come carbonili, nitroaromatici,alchene, polieni.

Vengono condotti in reattori fotochimici UV 300-400 e 400-700 nanometri. Si tratta di reazioni con

meccanismo radicalico: si verifica la promozione degli elettroni di valenza ad orbitali

energeticamente più elevati rispetto a quello fondamentale. 4

VALIDAZIONE DEI METODI DI ANALISI

Per poter utilizzare un metodo analitico di analisi, questo metodo a sua volta deve essere ,

VALIDATO

ossia il metodo analitico è giustificato solo se ne è dimostrata la validita’.

L’analisi deve rispondere ad alcune caratteristiche:

Precisione (riproducibilità dei dati, ossia l’accordo di tutti i dati ottenuti alla stessa maniera);

- Accuratezza (esattezza: quanto i nostri risultati si avvicinano al risultato verso o presunto

tale);

Limiti di rilevabilità (conc. min. che dia una risposta percettibile);

- Limiti di determinabilità quantitativa (conc. min. misurabile con una precisione e

- accuratezza accettabili);

Selettività (capacità di misurare l’analita in presenza di possibili impurezze);

- Intervallo e linearità (intervallo di conc. deve esistere una relazione lineare tra conc. e

- risposta).

La preparazione dei medicinali è soggetta a rigorose norme nazionali ed internazionali (i principi

attivi da impiegare devono essere conformi a quanto riportato nei codici di purezza che sono

rappresentati dalle Farmacopee e da altri testi di riconosciuta validità, come il CODEX).

Le farmacopee rappresentano il codice di purezze per le sostanze ad uso farmaceutico.

Un prodotto è di qualità “farmacopea” quando è conforme a tutte le specifiche descritte nella

monografia; tali specifiche costituiscono requisiti obbligatori per tutto il periodo di validità della

preparazione.

Le analisi da effettuare su un farmaco allo scopo di garantirne la qualita’ sono molteplici:

composizione (p.a., eccipienti, eventuali impurezze): analisi dei medicinali

- formulazione farmaceutica: tecniche

- efficacia: farmacologia

- altro (eventuale sterilita’ del preparato, recipiente impiegato)

-

Monografie

Le monografie della farmacopea sono un insieme di specifiche per la determinazione e la verifica

della qualità di una sostanza per uso farmaceutico. Si dividono:

− Monografie generali

− Forme farmaceutiche

− Materie prime

− Preparazioni farmaceutiche specifiche

− Preparazioni omeopatiche

Dal punto di vista analitico vengono riportati i metodi qualitativi per l’identificazione del farmaco e i

metodi quantitativi per la determinazione del titolo. Vengono inoltre riportati i metodi qualitativi e

quantitativi per la determinazione delle impurezze.

I risultati di una analisi quantitativa dipendono da due misure:

- Quantità (massa o volume) del campione a disposizione da analizzare;

- Quantità di analita nel campione.

La quantità di analita è espressa come %, cioè come rapporto tra la quantità di analita presente nel

campione/quantità totale di campione (x100). 5

Classificazione dei metodi quantitativi

Con i metodi analitici quantitativi si misura

una particolare proprietà fisica “m” del

nostro analita e in base alla qualita’ fisica

misurata avremmo diversi tipi di analisi

quantitativa (vedi foto).

ANALISI QUANTITATIVA

La proprietà fisica “m” deve essere correlata in maniera nota e riproducibile con la quantità di

analita presente. Spesso c’è una corrispondenza (proporzionalità diretta) tra la proprietà fisica e la

quantità di analita presente nel campione:

Qa = k x M

Qa (quantità di analita presente nel campione)

k (costante di proporzionalità)

M (misura della proprietà fisica)

Quando K è nota i metodi si dicono assoluti, e significa che c’è una proporzionalità diretta (significa

che c’è un coefficiente angolare di una retta) tra la misura della proprietà fisica e la quantità di

analita. I metodi assoluti sono i seguenti:

- Metodi gravimetrici

- Metodi volumetrici

- MNR

Quando k non è nota i metodi sono detti metodi relativi, ovvero:

- Cromatografia (GC, HPLC)

- Spettrometria (UV,IR)

- Fluorimetrica

Quando k non è nota occorre determinarla e la fase di determinazione della costante di

proporzionalita’ è detta calibrazione.

Questa fase si esegue su uno standard di analita puro a quantità nota. La purezza dello standard

deve essere determinata con un metodo assoluto.

Si preparano dei campioni a diverse concentrazioni note, e se ne misura l’assorbanza, quindi

mettiamo a confronto l’assorbanza con la concentrazione di analita. In realta’ non c’è

proporzionalita’ diretta tra l’assorbanza A e la concentrazione:

 

A = a b c

a= costante

b= cammino ottico

c= concentrazione dell’analita.

I campioni vengono sottoposti alla misura dell’assorbanza e i risultati vengono riportati su un

grafico, dove in ascissa dove c’è la concentrazione e in ordinata c’è l’assorbanza: ad ogni

concentrazione corrisponderà una misura dell’assorbanza; otteniamo una retta passante per

l’origine. In questo modo conosciamo k (il coefficiente angolare indica la pendenza della retta). 6

La curva ottenuta è una curva di taratura.

Ottenuta la curva di taratura siamo in

grado di risalire alla concentrazione X del

nostro analita nel campione. L’incognita

della nostra analisi è la concentrazione,

ossia la quantità di analita nel campione.

Come facciamo? Abbiamo il nostro campione, lo sottoponiamo all’analisi e quindi otterremo una

certa assorbanza che riporteremo sulla retta: nota l’assorbanza e nota la k si può risalire alla

concentrazione incognita, infatti a questa assorbanza corrisponde nel grafico una certa Cx (che è

comprese tra quelle poste all’analisi).

Se non abbiamo tanto campione, non conviene scegliere un metodo analitico che prevede tahnte

misure.

L’analisi quantitativa si può suddividere in:

• Metodi chimici:

- Metodi Gravimetrici

- Metodi volumetrici

• Metodi chimico-fisici

- Metodi elettroanalitici

- Metodi spettroscopici

- Altri metodi

Metodi chimici di analisi

Lo scopo è sempre conoscere X, cioè la quantità di analita presente nel campione. Il nostro analita

A in quantità incognita X viene sottoposto ad una reazione, in particolare ad un reattivo R, a fornire

un prodotto di reazione AmRn in quantità Z.

Una reazione chimica per poter essere utilizzata deve avere i suoi

coefficienti stechiometrici noti. La reazione deve essere rapida,

riproducibile e quantitativa (cioè completamente spostata a

destra). Non si devono avere reazioni secondarie.

Come indaghiamo la quantità X di A? O andando a conoscere la

quantità Z del prodotto finale oppure andando a conoscere la

quantità Y di reattivo utilizzato nella reazione.

Rispettivamente:

- Con i metodi gravimetrici si indaga la quantità Z di prodotto finale. I metodi gravimetrici

consistono nel trasformare l’analita in un precipitato insolubile, il quale viene pesato.

- Con i metodi volumetrici si indaga la quantità di reagente Y, cioè risaliamo alla quantità

X di A presente nel campione attraverso la quantità Y di reattivo consumato.

In pratica: in una buretta (vetreria tarata) è presente R e nella beuta è presente A, si fa

percolare R nella beuta; ci sono dei sistemi che consentono di vedere quando la reazione

è completa (ad esempio con il p.equivalente, dove il numero di equivalenti di analita sono

uguali al numero di equivalenti di reattivo), quindi in base a quanto R è rimasto in buretta, 7

cioè quello non consumato si può risalire alla quantità di reattivo utilizzato, cioè quello

presente in beuta. Questo è quello che faremo in laboratorio.

Metodi d’analisi chimico-fisici

A seconda di quanto campione abbiamo a disposizione le analisi si dividono in:

− Macroanalisi (campione tra i 100-500 mg): in laboratorio si lavora su queste quantità di

campione per facilitare la lettura della misura e perché i costi sarebbero troppo elevati se

facessimo un’analisi su campioni molto piccoli

− Semimicroanalisi (campione tra 10 e 100 mg)

− Microanalisi (campione tra 1 e 10 mg)

− Ultramicroanalisi (campione <1mg)

Una tipica analisi quantitativa consta di una serie di fasi:

1. Scelta del metodo di analisi

La scelta del metodo è la fase cruciale per chi deve condurre un’analisi. Si deve fare sempre

un compromesso tra l’accuratezza che vogliamo da quell’analisi ed il budget che abbiamo a

disposizione: più vogliamo che il metodo sia accurato e più sarà costoso e più servirà un

certo tempo.

La scelta del metodo dipende anche dalla quantità di campione a disposizione: se abbiamo

tanto campione possiamo permetterci di scegliere un metodo che ha bisogno di curve di

taratura, mentre se abbiamo un campione molto piccolo dobbiamo scegliere un metodo che

sia efficace subito.

2. Campionamento

Anche il campionamento è una fase cruciale in quanto dobbiamo essere sicuri che quello

che andiamo a prelevare rappresenti tutti il campione, cioè che a composizione del

campione da analizzare deve essere rappresentativa dell’intero lotto. Un’analisi non potra’

essere più accurata dell’accuratezza con cui è stato fatto il campionamento, quindi un

possibile errore in questa fase compromette l’intera analisi. Cioè più accurato è il

campionamento, più accurata (esatta) è l’analisi (cioè l’a bonta’ dell’esattezza del risultato).

Il campionamento è piuttosto facile se noi siamo in presenza di un campione omogeneo,

come lo è un gas o una soluzione che non presenti delle sospensioni; al contrario non è

facile se abbiamo una sospensione che tende a depositare sul fondo. Nel campionamento

sorgono problemi infatti quando si hanno solidi sospesi, liquidi immiscibili o quando il

campione è diviso in una serie di contenitori; in quest’ultimo caso, ad esempio se abbiamo

50 contenitori, questi vengono numerati e, a caso (random), se ne prelevano 5, dopo di che

se il contenuto del contenitore è omogeneo si procede con l’analisi, ma se c’è una

sospensione, prima di essere prelevato il contenuto, deve essere agitato il contenitore e si 8

fanno dei prelievi a più profondità.

3. Preparazione del campione

Si ha la raccolta di tutti i prelievi, si rendono omogenei e si definiscono i campioni da

analizzare (generalmente da 2 a 5).

4. Definizione dei campioni replicati

I campioni prelevati andranno a costituire i campioni replicati, tutti della stessa grandezza

(cioè con una quantità di campione uguale), e che saranno sottoposti allo stesso metodo

analitico nello stesso tempo e nelle stesse condizioni. Questo è utile per poter fare una

media delle misure per avvicinarsi di più al valore reale.

5. Solubilizzazione