Cromatografia di affinità e Cromatografia HPLC

Cromatografia di affinità

Una tecnica molto interessante è la cromatografia di affinità. In questo caso, sui granuli della fase stazionaria viene legata una molecola con alta affinità per la proteina che si vuole isolare. Tale molecola viene chiamata ligando. Per esempio, se si vuole ottenere un enzima, si può utilizzare la molecola substrato di quell’enzima. Oppure, per una generica proteina, si può utilizzare un anticorpo della proteina stessa.

Chiaramente, in questi casi si devono conoscere in anticipo le caratteristiche della proteina che si sta cercando. In questa tecnica, le proteine bersaglio interagiscono fortemente con la fase stazionaria. Per eluirle, dopo che le altre proteine sono già uscite dalla colonna, si può aggiungere alla fase mobile una soluzione contenente un’elevata quantità del ligando in forma libera. Quando il ligando in forma libera si sostituisce ai ligandi immobilizzati sulla fase stazionaria, le proteine cercate vengono finalmente liberate ed escono dalla colonna.

Cromatografia HPLC

Normalmente, in molti laboratori di biologia molecolare, viene utilizzata la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC, dall’inglese High Performance Liquid Chromatography). In questa tecnica, viene utilizzata una pompa per spingere la fase mobile attraverso una fase stazionaria costituita da granuli minuscoli. Si tratta di sfere piccolissime, di diametro tra 2 e 10, di solito fatte di polimeri a base di silice. La superficie di scambio tra la fase mobile e quella stazionaria diviene enorme, ma allo stesso tempo sono necessarie altissime pressioni per il passaggio del liquido (fino a circa 500 bar). Le colonne utilizzate in questi casi sono di metallo (per resistere alle pressioni) e di dimensioni ridotte. Con la HPLC si riescono a frazionare proteine in modo molto più efficiente e in tempi molto più brevi rispetto alle altre tecniche.