Riassunto Biologia molecolare

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Nucleotide e struttura del DNA

Il nucleotide è l’unità funzionale del DNA e dell’RNA, costituito da uno zucchero collegato mediante due legami fosfodiesterici a livello di C3 e C5 a due gruppi fosfati. Allo zucchero è collegata una base azotata che può essere una pirimidina (T, U e C) o una purina (A e G). Secondo la regola di Chargaff vi è lo stesso numero di A e T e di G e C (basi complementari). Il DNA è costituito da una elica a doppio filamento antiparallelo (un filamento è in direzione 5’-3’ l’altro 3’-5’): le basi azotate sono rivolte all’interno mentre l’ossatura zucchero-fosfato all’esterno (carica (-), ad essa si legano proteine basiche per neutralizzare la carica).

Superavvolgimento e replicazione del DNA

Ogni base del filamento nucleotidico dista 3,4 Armstrong da quella adiacente ed è sfalsata di 36°; la doppia elica fa un giro completo in 34 Armstrong. Il DNA è il portatore di tutta l’informazione genica della cellula e consta di più geni (sequenze di DNA codificanti per un RNA). Ciò è stato dimostrato mediante la coniugazione batterica o la trasfezione eucariotica. Per essere impacchettato nella cellula, il DNA deve essere superavvolto: se l’avvolgimento avviene in senso orario si ha superavvolgimento (+) e il DNA si compatta (ci mette meno di 34 Armstrong per fare un giro completo), se avviene in senso antiorario si ha superavvolgimento (-) e il DNA risulta più facile da aprire. Ciò avviene solo in molecole di DNA chiuse.

Processi di replicazione e trascrizione

La replicazione è semiconservativa: entrambi i filamenti funzionano da stampo per nuovi polinucleotidi complementari. La DNA polimerasi è l’enzima responsabile della replicazione ed è un enzima altamente processivo, ovvero che resta sempre saldamente legato al DNA. Vi sono degli enzimi che effettuano dei tagli in punti all’interno dei filamenti nucleotidici: sono le endonucleasi e ciò che provocano è la comparsa di un nick (mancanza del legame fosfodiesterico tra due basi adiacenti, tagliano uno o due filamenti). Altri enzimi, le esonucleasi, smangiucchiano il filamento a partire dalle estremità. Queste due tipologie di enzimi possono essere processive o randomizzate. Il doppio filamento di DNA può essere separato per mezzo di denaturazione (elevate temperature). È un processo reversibile: abbassando la temperatura i due filamenti possono essere rinaturati.

Denaturazione e ibridazione

Con l’assorbimento posso verificare se l’ho denaturato o meno (misuro l’assorbanza del preparato a 260 nm, fino a 80° resta 1 che è quella del doppio filamento poi sale rapidamente fino a raggiungere un valore massimo dopo aver superato la temperatura di melting in cui metà popolazione è stata denaturata). Per vedere se il gene è stato o meno espresso uso invece la tecnica dell’ibridazione (aggiungo acidi nucleici a singolo filamento e osservo cosa resta attaccato al mio filtro di cellulosa).

Genoma e trascrizione dell'RNA

Il genoma è costituito dall’insieme di tutti i cromosomi i quali sono costituiti da più geni. Nei doppi filamenti di DNA, uno di questi prende il nome di filamento codificante o di senso mentre l’altro, il suo complementare, è il filamento stampo o antisenso. Quest’ultimo è il filamento da cui verrà trascritto l’RNA messaggero (sono complementari). L’RNA polimerasi è l’enzima di questo processo e prende nucleotidi dall’ambiente per assemblarli in un filamento complementare allo stampo. L’espressione genica comprende questa prima fase di trascrizione e una seconda fase di traduzione. In quest’ultima, l’mRNA codificante viene letto dai ribosomi che associano ad ogni tripletta nucleotidica (codone) un aminoacido.

Traduzione e struttura dell'mRNA

La traduzione avviene dal 5’ al 3’; ciò significa che il codice è a triplette. Gene e prodotto sono detti colineari se il numero dei nucleotidi/3 è uguale al numero degli aminoacidi della catena. Il gene è interamente rappresentato nell’mRNA mentre la regione che rappresenta la proteina da tradurre è detta regione codificante: la relazione tra DNA e proteina è detta codice genetico. Al 5’ presenta una regione 5’ UTR, al 3’ una 3’ UTR ed entrambe non vengono tradotte. Regione codificante per una proteina e regione di controllo (riconosciuta da proteine regolatrici) insieme costituiscono l’informazione genetica. Le proteine (tra le quali quelle regolatrici) sono trans-agenti, ovvero sono prodotti diffusibili che agiscono su numerosi bersagli; le sequenze sul DNA sono cis-agenti, influenzano esclusivamente ciò che è ad esse contiguo.

Mutazioni e geni paraloghi

Le mutazioni su elementi cis-agenti influenzano soltanto il DNA cui sono associati mentre le mutazioni su trans-agenti influenzano l’espressione di numerosi geni (non avremo la produzione di alcun messaggero). Parliamo di cornice di lettura aperta (ORF) quando abbiamo una cornice di lettura, delimitata da AUG e uno stop, che è rappresentata esclusivamente da triplette codificanti per aa. Parliamo di cornice di lettura chiusa nel caso in cui una cornice non può avere la funzione di codificare per un polipeptide a causa del fatto che presenta troppi codoni di stop in mezzo. Solitamente la cornice di lettura aperta è rappresentata da una sola delle 3 possibili fasi di lettura. I geni interrotti sono costituiti da esoni (sequenze codificanti che vengono rappresentate nel messaggero) e introni (sequenze non codificanti, altamente ripetute, che saranno soggette a splicing a livello di siti ben precisi).

Geni interrotti e splicing

Il gene interrotto è quindi più lungo del suo messaggero maturo: gli introni vengono tagliati e gli esoni si troveranno ad essere più vicini tra loro ma nello stesso ordine (gli esoni sono rappresentati nel messaggero e ciò è dimostrabile per mezzo dell’ibridazione). Se in un gene gli introni sono assenti c’è colinearità con il suo messaggero. Le mutazioni avvengono sia negli introni che negli esoni ma se ne osservano meno in quest’ultimi perché sono soggetti a maggiore pressione selettiva: sistemi di riparazione correggono le mutazioni sfavorevoli e conservano quelle favorevoli, negli introni è meno importante. Se avviene una mutazione negli esoni si altera la sequenza polipeptidica mentre se avviene negli introni può andare alterato il sito di splicing, alterando anche la modificazione del messaggero.

Geni paraloghi e evoluzione

Geni paraloghi (come i geni delle globine appartenenti alle classi alfa e beta) derivano da uno stesso gene ancestrale. Presentano un’organizzazione strutturale conservata e anche una buona conservazione a livello di 3 esoni (delimitano il gene) e del primo introne mentre per quanto riguarda il secondo introne, il più lungo e variabile, è meno conservato. Il numero e le dimensioni degli introni vanno a condizionare la lunghezza e la struttura dei geni (più introni ho, più il gene sarà grande) perché gli esoni non tendono ad aumentare.

Sistemi virali e mRNA

Nei sistemi virali, in cui i genomi sono estremamente corti e con le informazioni il più compattate possibile, sono state sviluppate delle strategie per codificare più geni sovrapposti. Una strategia è quella degli start codoni interni, in alternativa si verifica frameshift programmato, in modo da leggere più cornici di lettura aperte (non c’è una sola ORF, che ne sono di più, ciascuna codificante per una gamma di proteine diversa). In alternativa hanno adottato la tecnica dello splicing alternativo: tagliano a livello di siti di splicing diversi ottenendo messaggeri codificanti per proteine diverse. Possiamo avere esoni che si escludono a vicenda o in alternativa esoni opzionali. Con tutte queste strategie, i virus hanno aumentato la loro variabilità. L’mRNA è codificante ed è l’unità forma di RNA ad esserlo. È costituito da codoni (triplette di nucleotidi) codificanti per specifici aminoacidi: funge da stampo per la sintesi proteica.

tRNA e rRNA

• tRNA sono RNA transfer che hanno specifiche strutture terziarie e, per via della loro peculiari struttura, sono capaci di riconoscere specifiche sequenze (codoni) e associarvi un aminoacido. Tutti i tRNA hanno la stessa struttura e si associano col messaggero.
• rRNA sono filamenti nucleotidici che si associano a proteine ribosomiali per formare i ribosomi. Questi sono le macchine che offrono l’ambiente adatto ai tRNA e al mRNA perché avvenga il riconoscimento, la formazione delle catene polipeptidiche (non appena escono dall’ambiente ribosomiale, i polipeptidi nascenti si ripiegano). Gli rRNA hanno attività catalitica e funzionano da impalcatura per le proteine r.

Struttura e funzione del tRNA

I tRNA hanno tutti la stessa struttura a trifoglio (braccia a doppio filamento e anse a singolo), rappresentano e legano un solo aminoacido e portano in uno dei loro bracci la sequenza dell’anticodone, complementare a quella del codone presente sul messaggero. Ha 4-5 braccia: braccio accettore con un 3’OH libero e sporgente (ACC) a cui si lega l’aminoacido (vi viene trasferito per mezzo dell’intervento dell’aa-tRNA sintetasi, un enzima specifico per un determinato aminoacido che riconosce il tRNA corrispondente ad un aa e idrolizzando ATP lo lega al 3’), un braccio TpsiC (pseudouridina), un braccio dell’anticodone (riconosce un codone), un braccio D (diidrouridina) e un braccio extra di lunghezza variabile. Alcune basi sono conservate e altre semi-conservanti (per esempio è necessaria una purina in un punto ma è indifferente quale delle 2 sia). Nella struttura terziaria del tRNA, il trifoglio si piega a formare un angolo di 90° e vediamo braccio accettore e braccio TpsiC a formare un’unica elica e il braccio dell’anticodone e D che ne formano un’altra. Le basi a singolo filamento del braccio D e TpsiC formano legami H stabilizzanti tra loro.

Ribosomi batterici e eucariotici

Ribosomi batterici (70S) formati da una subunità maggiore (50S) e una minore (30S); ribosomi eucariotici (80S) formati da una maggiore (60S) e una minore (40S). La subunità minore è responsabile della localizzazione del riconoscimento del punto d’inizio; subunità maggiore e minore si associano sul messaggero, che prende contatti con entrambe e scorre all’interno di una fessura da esse formata.

RNA polimerasi e traduzione nei procarioti

La RNA polimerasi nei procarioti trascrive il messaggero a partire dal filamento stampo del DNA: ottengo un filamento complementare la cui estremità 5’ esce dall’enzima (trascrizione 5’-3’). Al 5’ si legano le subunità ribosomiali che cominciano a tradurre catene polipeptidiche 5’-3’. Dopo che l’estremità 5’ è stata tradotta intervengono delle endonucleasi che tagliano in pezzi il messaggero (che sta ancora venendo trascritto e tradotto, responsabile del primo taglio è la RNasi E) e delle esonucleasi degraderanno i frammenti. Il complesso di degradazione è il degradosoma e comprende la RNasi E, la PNPasi e un’elicasi. RNasi E ha attività endonucleasica all’N-t mentre al C-t tiene unite le altre componenti: l’elicasi svolge il messaggero con consumo di ATP mentre la PNPasi è un’esonucleasi. La poliadenilazione nei procarioti ha un ruolo nella degradazione. Il cistrone è l’unità del gene: se c’è una sola ORF si parla di monocistrone, se ce n’è più di una si dice policistrone. Tra lo stop di un cistrone e l’inizio dell’altro vi è la regione intercistronica che non viene letta dal ribosoma (si stacca e si riattacca all’inizio).

Maturazione degli mRNA negli eucarioti

Negli eucarioti il messaggero che viene trascritto va incontro a maturazione: il 5’ viene bloccato grazie all’aggiunta di una guanosina 3 Pi (guanilil/terminal transferasi, condensa GTP) con legame 5’-5’ che va a formare il cappuccio, la terminazione della trascrizione avviene per taglio nucleolitico e conseguente poliadenilazione (PAP) al 3’-OH libero che si è formato che va a costituire la coda poli(A) (di 200 A). Queste modifiche servono a stabilizzare il messaggero e sono importanti per la sua traduzione (la coda lega PABD e il cappuccio eIF4G, interagiscono tra loro chiudendo il messaggero ad ansa e aumentando la sua traducibilità). In seguito all’aggiunta del cappuccio si susseguono diversi eventi di metilazione: il cap0, presente in tutti i messaggeri, vede una metilazione a livello della guanina del GTP condensato, il cap1 vede una metilazione a livello del C2 del ribosio della prima base al 5’, il cap2 vede una metilazione a livello del C2 del ribosio della seconda base. Queste modifiche proteggono il 5’ dall’attacco da parte di esonucleasi.

Degradazione del messaggero

Per la degradazione del messaggero abbiamo due strategie e una prevede l’utilizzo di sequenze ARE destabilizzanti ricche di AU (AUUUA) che sono il bersaglio di endonucleasi: vengono legate e riconosciute da ARE-BP che recluta una endonucleasi che effettua un taglio (queste sequenze sono solitamente al 3’ e il taglio rimuove la coda di poli(A)) rendendo il frammento ora soggetto all’intervento dell’esonucleasi (Ccr4 o PARN). In alternativa, l’esonucleasi (esosoma) si lega alla sequenza leader al 5’ e dal cappuccio (chiuso ad ansa per mezzo dell’interazione tra eIF4G e PABD) comincia a rimuovere A dalla coda, fino a che non si dissocia PABD e viene degradato. L’altra strategia prende il nome di sistemi di sorveglianza: se vengono individuati codoni di stop (sequenze DSE) all’interno della sequenza codificante il messaggero diventa meno stabile e si innesca il taglio endonucleolitico e arrivano le esonucleasi. eRF è il fattore di rilascio che riconosce questi codoni di stop e richiama l’elicasi Upf1.

Trascrizione e traduzione nei procarioti ed eucarioti

Trascrizione e traduzione nei procarioti avvengono nello stesso compartimento (non abbiamo sistemi di membrana e di organelli interni) mentre negli eucarioti sono separate: gli RNA maturi devono essere trasferiti dal nucleo (dove vengono sintetizzati) al citoplasma (dove svolgeranno la loro funzione). Alcuni mRNA vengono tradotti random nel citoplasma, altri in siti specifici (ASH1 nel lievito è trasportato dalla madre alla gemma dove verrà tradotto, codifica per una proteina che reprime l’endonucleasi HO. She2 lo riconosce, She3 lo lega a She1 (actina) e viene portato nella gemma, dove verrà espresso).

Funzione del ribosoma

Il ribosoma facilita l’interazione tra messaggero e aa-tRNA, offrendo il giusto ambiente catalitico. Presenta più siti attivi e due siti di legame per i tRNA carichi: sito A (aa-tRNA) e sito P (pp-tRNA). I due siti sono praticamente paralleli; l’mRNA all’interno viene piegato di 45° e l’interazione codone-anticodone determina la rotazione di 26° e l’idrolisi di GTP (avviene sempre nello stesso sito il legame di proteine GTPasi, il centro GTPasico, ovvero a livello del peduncolo): l’aa-tRNA porta l’aa nel sito catalitico. Per 2/3 è costituito da rRNA: la subunità minore vede un corpo, un collo, una piattaforma e una testa mentre la subunità maggiore un peduncolo e una protuberanza centrale. L’inizio prevede il riconoscimento e localizzazione del punto d’inizio sul messaggero (AUG) da parte della subunità minore. Questo determinerà l’assemblaggio della subunità minore e il Met-tRNA si troverà nel sito P (è l’unico aa in grado di legare il sito P anche senza che vi sia un polipeptide legato). Avviene poi l’allungamento, fase in cui nel sito A entra l’aa-tRNA corrispondente al codone esposto, vi si lega, i due tRNA nei due siti A e P sono sufficientemente vicini da permettere la formazione del legame peptidico tra l’aa nell’A e il polipeptide nascente nel P. Il tRNA vuoto esce dal ribosoma, il pp-tRNA ora nell’A trasloca nel sito P e nell’A viene esposto il codone successivo. La terminazione avviene quando viene rilasciata la catena in seguito all’esposizione di un codone di stop a livello del sito A. L’idrolisi di GTP fornisce l’energia necessaria ad ogni passaggio.

Subunità e fattori di inizio

La subunità minore si va a localizzare a livello della sequenza di Shine Dalgarno (AGGAGG), presente sul messaggero a monte di AUG, per mezzo di una sequenza complementare sull’rRNA. Vi sono alcuni IF (fattori di inizio della trascrizione) che intervengono in questa prima fase: IF3 è legato vicino al sito A, facilita l’interazione subunità minore-messaggero e impedisce l’associazione prematura della subunità maggiore, IF1 si lega al sito A e controlla l’interazione tra mRNA-subunità minore-IF3 e favorisce il legame di IF2, IF2 è una GTPasi che riconosce l’aa-tRNA iniziatore (tRNA per la metionina) e ne favorisce l’ingresso nel sito P. L’attività GTPasica di IF2, che determina un cambio conformazionale nel ribosoma provocando il rilascio degli IF, è indotta dall’avvicinamento della subunità maggiore. L’iniziatore (Met-tRNA) ha l’aa che porta un gruppo formile (blocco post-caricamento per impedirne l’utilizzo nell’allungamento) e IF2 riconosce l’assenza di appaiamento tra la prima base al 5’ e la complementare al 3’.

Traduzione negli eucarioti

Negli eucarioti, il cappuccio ha un ruolo essenziale: viene riconosciuto dalla subunità minore che va poi a scansionare il messaggero fino a che non riconosce l’AUG d’inizio. Questo è circondato da due basi conservate: una Pu due basi a monte e una G subito a valle. In assenza di cappuccio, le sequenze IRES al 5’ permettono il riconoscimento diretto da parte della subunità minore. Per l’inizio della traduzione, in questo caso abbiamo la formazione di un complesso ternario 43S (tRNA iniziatore + eIF2-3 + subunità minore) che scansiona.