Riassunto esame Biologia e biologia molecolare, Prof. Pedretti Alessandro, libro consigliato Biologia molecolare , Alberts

MECCANISMI DI RIPARAZIONE DEL DNA

Vi  sono  dei  meccanismi  di  riparazione  specifici  per  le  specifiche  lesioni  che  il  DNA  può  subire,  

e  c’è  un’alta  comunicazione  tra  le  varie  vie  di  riparazione,  in  maniera  tale  da  garantire  quanto  

più  possibile  il  mantenimento  della  stabilità  genomica.    

Tutte  le  cellule  sono  soggette  a  processi  che  causano  danno  agli  acidi  nucleici,  in  particolare  al  

DNA:   si   calcola   che   le   cellule   umane   siano   sottoposte   a   un   livello   di   danno   di   circa   10 /10  

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lesioni   sul   DNA   al   giorno.   La   principale   categoria   di   lesioni   che   le   cellule   eucariotiche  

subiscono   sono   quelle   che   dipendono   dal   metabolismo   cellulare.   Ci   sono   lesioni   di   tipo  

endogeno,   causate   dalla   produzione   di   specie   ROS   dal   metabolismo   mitocondriale,   come  

l’ossidazione   della   guanina   e   la   formazione   di   siti   abasici   sul   DNA,   che   sono   la   fonte   maggiore  

di   mutazioni.   Le   lesioni   esogene   sono   causate   dalle   radiazioni   ultraviolette,   che  

contribuiscono  per  una  grossa  quota  alle  lesioni  presenti.  Considerando  il  numero  di  cellule  

umane,  quelle  che  necessitano  di  riparazione  sono  una  quantità  piuttosto  elevata.    

I   meccanismi   di   riparazione   garantiscono   l’omeostasi   di   questo   processo,   cioè   il  

mantenimento   della   stabilità   genomica.   Vi   sono   tuttavia   condizioni   in   cui   il   danno   non   può  

essere   riparato   completamente,   oppure   non   viene   riparato   completamente   in   maniera  

efficiente.   Ci   sono,   infatti,   dei   meccanismi   che   sono   intrinsecamente   fonte   di   mutazione,  

perché   bypassano   la   lesione   senza   ripararla,   fissandola   nel   genoma,   in   modo   da   evitare   che   la  

cellula   vada   incontro   alla   morte   cellulare   programmata.   Questi   sistemi   fanno   uso   di   DNA  

polimerasi   a   bassa   fedeltà,   che   non   vengono   arrestate   da   danni   sul   DNA   e   consentono   di  

continuare   la   replicazione   introducendo   un   nucleotide   a   caso.   Le   mutazioni   sono   causa  

d’instabilità   genetica,   sono   il   presupposto   dell’evoluzione   ma   anche   di   patologie   come   i  

tumori,  la  cui  la  principale  componente  è  da  ricercare  nella  mancata  riparazione,  causata  da  

difetti   enzimatici   nel   processo   stesso.   Inoltre   le   mutazioni   non   riparate   sono   alla   base   delle  

malattie  di  tipo  ereditario,  soprattutto  quelle  neurodegenerative.    

Una   delle   lesioni   chimiche   endogene,   ad   esempio,   è   la   formazione   della   8-­‐ossoguanina,   che   se  

non   riparata   dà   origine   a   trasversione,   per   cui   una   purina   viene   sostituita   con   una   pirimidina.  

Le   trasversioni   hanno   un   effetto   molto   più   marcato   delle   transizioni,   perché   la   degenerazione  

del  codice  genetico  non  fa  distinzione  tra  un  cambiamento  di  una  purina  con  una  purina  o  di  

una   pirimidina   con   una   pirimidina,   mentre   lo   scambio   di   una   purina   con   una   pirimidina   o  

viceversa  causa  un’alterazione  non  trascurabile.      

Le   lesioni   esogene   sono,   come   detto,   causate   dalle   radiazioni   di   tipo   ultravioletto   che  

provocano  la  formazione  di  dimeri  di  pirimidine.    

Gli  errori  dovuti  ai  processi  di  replicazione  sono  causati  da  errori  nel  processo  di  editing  della  

DNA   polimerasi;   gli   enzimi   della   via   di   riparazione   del   mismatch   assicurano   un   più   elevato  

grado   di   fedeltà   al   processo   di   replicazione   (di   un   fattore   di   10 ).   Difetti   nel   processo   di   proof  

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reading   o   nella   via   di   riparazione   del   mismatch   hanno   un   impatto   sul   genoma,   riguardo  

l’introduzione  di  lesioni  che  possono  fissare  delle  mutazioni.    

A   differenza   del   DNA,   per   il   quale   sono   diverse   decine   gli   enzimi   coinvolti   nelle   vie   di  

riparazione,  nel  caso  del  RNA  questi  meccanismi  non  sono  presenti:  infatti,  mentre  il  DNA  non  

può   essere   rimpiazzato,   le   molecole   di   RNA   possono   essere   sostituite   a   un   costo   energetico  

limitato  per  la  cellula.    

Il  mantenimento  dell’identità  genomica,  infatti,  ha  un  elevato  costo  energetico  per  la  cellula,  

ascrivibile   al   mantenimento   dell’omeostasi   degli   enzimi   deputati   alla   riparazione   del   danno,  

sia   dal   punto   di   vista   del   numero   di   geni   che   fanno   capo   a   queste   vie,   sia   perché   durante   i  

diversi   step   dei   processi   di   riparazione   viene   consumato   ATP.   Normalmente   meno   di   una  

lesione  su  mille  diventa  una  mutazione,  a  garanzia  del  fatto  che  i  processi  sono  estremamente  

efficienti.    

Vi  è  una  specificità  di  attività  degli  enzimi  di  riparazione:  diverse  lesioni  sono  riparate  da  vie  

diverse,  anche  se  esiste  un  elevato  grado  di  ridondanza  tra  loro.  Ad  esempio,  per  i  dimeri  di  

pirimidine,   dato   che   sono   estremamente   mutagenici,   vi   sono   almeno   due   meccanismi,  

appartenenti   a   vie   distinte,   che   consentono   di   rimuovere   queste   mutazioni,   secondo   il  

momento  durante  cui  la  lesione  viene  riconosciuta.  Se  viene  riconosciuta  durante  il  processo  

di   replicazione,   su   un   filamento   di   DNA   singolo,   viene   riparata   attraverso   il   processo   che  

coinvolge  le  DNA  polimerasi  a  bassa  fedeltà  (riparazione  per  superamento  della  translesione,  

TLSB  translesion  synthesis  bypass);  se  invece  la  lesione  viene  riconosciuta  su  una  molecola  di  

DNA   già   sintetizzata,   interviene   la   via   di   escissione   nucleotidica,   la   via   NER.   Vi   sono   delle  

patologie  umane,  come  lo  xeroderma  pigmentoso,  associate  a  difetti  enzimatici  della  via  NER.    

Il  processo  di  riparazione  sul  DNA  è  garantito  dal  fatto  che  il  DNA  è  a  doppio  filamento,  per  cui  

c’è   un   filamento   dove   è   presente   il   danno   e   un   filamento   non   danneggiato   che   può   essere  

usato  come  stampo  per  ricostruire  la  sequenza  contenente  il  danno.      

Vi  sono  cinque  vie  principali  responsabili  dei  processi  di  riparazione  dei  vari  tipi  di  danno  e  

due  vie  minori  (le  ultime  due).      

  La  via  BER  (Base  excision  repair)  è  la  via  principale  che  rimuove  lesioni  coinvolgenti  

• modifiche   chimiche   o   fisiche   su   singoli   nucleotidi   e   che   non   comportano   modificazione  

conformazionali  del  DNA.  Questa  via  rimuove  l’ossidazione  sulle  basi  e  corregge  danni  

come  le  lesioni  dovute  ad  agenti  alchilanti  che  causano  la  metilazione  o  l’alchilazione  

delle  basi.  Questa  via  è  deputata  anche  alla  correzione  dei  siti  abasici,  siti  in  cui  viene  

rotto   il   legame   N-­‐glicosidico   tra   lo   zucchero   e   la   base:   questi   siti   sono   estremamente  

mutagenici  perché  durante  la  replicazione  non  rappresentano  un  segnale  informativo  

per  la  DNA  polimerasi.  Questa  via  ripara  anche  le  rotture  su  un  singolo  filamento  del  

legame   fosfodiestereo,   i   single-­‐strand   break:   radiazioni   ionizzanti   possono   causare  

queste   rotture.   La   via   BER   essenzialmente   rimuove   il   danno   attraverso   la   rimozione  

della  base  danneggiata,  per  cui  danni  che  coinvolgono  più  basi  non  vengono  rimossi  da  

questa   via.   La   specificità   di   questa   via,   nel   riconoscere   la   lesione,   è   il  

riconoscimento  della  lesione  chimica  da  parte  degli  enzimi.  Le  lesioni  non  alterano  

la   struttura   locale   del   DNA.   I   geni   di   queste   vie   sono   essenziali   per   le   cellule:  

tipicamente,   negli   enzimi   chiave   di   questa   via   non   sono   state   riscontrare   mutazioni  

compatibili  con  l’insorgenza  di  patologie,  a  parte  un  certo  grado  di  correlazione  degli  

enzimi   di   questa   via   con   l’invecchiamento,   dove   si   assiste   a   un   danno   ossidativo   a  

livello  neuronale  che  è  anche  un  fattore  comune  di  molte  patologie  neurodegenerative.  

La   via   BER   è   una   via   molto   importante   per   l’insorgenza   di   fenomeni   di   resistenza   ai  

farmaci   chemioterapici,   come   agenti   alchilanti   o   metaboliti.   Lo   step   chiave   è   il  

riconoscimento   della   lesione,   da   parte   dell’enzima   glicosidasi,   che   rimuove   la   base  

lesionata   producendo   un   sito   abasico,   riconosciuto   dall’endonucleasi   apurinica-­‐

apirimidinica.  Una  serie  successiva  di  enzimi  è  in  grado  di  riparare  la  lesione.  

  1. La   glicosidasi   idrolizza   il   legame   N-­‐glicosidico   tra   lo   zucchero   e   la   base,   generando   il  

sito  abasico.    

2. L’enzima  APE1  riconosce  il  sito  e  taglia  al  5’  del  sito  lasciando  libero  un  3’  OH  che  serve  

come  primer  per  la  polimerasi.    

3. La  polimerasi  β,  oltre  a  svolgere  una  normale  attività  di  polimerizzazione,  completa  la  

reazione  di  rimozione  del  sito  abasico  inducendo  la  rottura  del  legame  fosfodiestereo  

dello   zucchero   che   rimane   e   il   fosfato   al   5’   della   molecola   di   DNA   nella   regione   che  

viene  corretta.  Successivamente  la  polimerasi  introduce  il  nucleotide  corretto  leggendo  

il  filamento  stampo.  R