Schemi Biochimica II parte I

Biochimica II: proteine che legano l’ossigeno

Comparse con l’evoluzione quando la vita è passata dall’essere anaerobia all’essere aerobia ↳ e quindi l’ossigeno si è reso necessario per la vita → estrazione di energia dalle molecole che hanno funzione di combustibile nettamente superiore (15 volte) rispetto all’estrazione effettuata in condizioni anaerobie.

Problema: scarsa solubilità dell’ossigeno in acqua (35 mg/L a 50°) a causa della sua apolarità → problemi nella diffusione per distanze oltre 1 mm in tempi ragionevoli (compatibili con la vita). → organismi dotati di cellule in grado di sfruttare direttamente l’ossigeno disciolto nei liquidi estremamente semplici (Cnidari, Hydra.) con cellule a diretto contatto con cavità gastrovascolari contenenti il liquido con l’ossigeno.

→ Organismi più complessi c’è bisogno di un sistema vascolare in grado di distribuire l’ossigeno e i nutrienti a tutte le cellule dell’organismo → sviluppo di un sistema cardiocircolatorio.

Ossigeno legato ad una struttura proteica → mioglobina (proteina monomerica che lega ↳ l’ossigeno con funzione di deposito e conservazione nelle cellule muscolari striate, scheletriche e anche cardiache) ed emoglobina (proteina tetramerica con funzione di trasportare l’ossigeno nel sangue e di distribuirlo a tutti gli organi, tessuti e cellule dell'organismo).

Studiate da Perutz e Kendrew → Premio Nobel per la chimica nel 1962 per aver ↳ determinato la struttura tridimensionale dell’emoglobina e della mioglobina.

Come viene legato l’ossigeno

Ossigeno scarsamente solubile e non può diffondere in tempi ragionevoli oltre 1 mm → ↳ bisogna legarlo.

Può essere legato abbastanza facilmente da certi ioni metallici (Fe²⁺ e Cu⁺). ↳ Ma ferro e il rame in forma ionica legano una molecola di ossigeno → cedono un elettrone all’O (ione ferroso 2+ diventa ione ferrico 3+ e ione rameoso + diventa ione rameico 2+).

Molecola di ossigeno dopo aver catturato questo elettrone non è più la stessa: anione ↳ superossido O₂^- = radicale libero fortemente reattivo e fortemente ossidante in grado di procurare dei danni rilevanti alle cellule.

→ Molecola di ossigeno molto pericolosa, deve subire una riduzione completa catturando simultaneamente 4 elettroni, se non arrivano simultaneamente si ha una riduzione parziale della molecola di ossigeno con formazione di ROS (reactive oxygen species).

→ Gruppo EME: struttura utilizzata nel nostro organismo che permette di legare e trasportare l’ossigeno senza produrre superossido.

Gruppo prostetico = cofattore organico che lega una catena ↳ polipeptidica → costituito da una componente organica (protoporfirina IX) e da una componente inorganica (ione Fe²⁺).

Componente organica: si parte dal comprendere come è fatta una semplice molecola organica eterociclica aromatica pentatomica con 4 C e 1 N chiamata pirrolo → 4 anelli pirrolici insieme e li colleghiamo tra loro mediante 4 ponti metinici = tetrapirrolo.

Ponti metinici (CH) = ponti costituiti da un solo atomo di C, legato ad un H.

Tetrapirrolo prende il nome di porfirina e in questa struttura i 4 atomi di N sono ↳ tutti rivolti verso il centro.

Porfirina IX = tetrapirrolo sostituito, in cui i 4 anelli pirrolici portano legati a sé dei gruppi sostituenti che possono essere diversi tra loro.

Sostituenti della protoporfirina IX

Sostituenti della protoporfirina IX: ↳

• 4 gruppi CH₃, uno per ogni anello pirrolico.
• 2 catene propioniliche.
• 2 gruppi vinilici.

IX perché prende il nome dai sostituenti e da come sono disposti. ↳

→ Mettiamo lo ione Fe²⁺ al centro della struttura della protoporfirina IX = eme.

Ione ferroso forma 6 legami di coordinazione (esacoordinato), 4 dei quali sono con gli ↳ atomi di azoto della protoporfirina che giacciono sullo stesso piano (la struttura del tetrapirrolo planare e i C dell’anello ibridato sp²). → elettroni dei ponti metinici e tutti i doppi legami creano una struttura di risonanza, delocalizzazione elettronica diffusa e la conseguenza: molecola in grado di assorbire specifiche radiazioni elettromagnetiche nel visibile che conferiscono la colorazione rossa alla molecola (colore rosso del sangue è dato dall’eme, anche colore dei muscoli).

→ Quinto e sesto legame di coordinazione vanno rispettivamente uno sotto e uno sopra il piano dell’eme → ferro = geometria ottaedrica.

• Quinto legame di coordinazione → con la catena laterale dell’istidina = "istidina prossimale (F8)" (catena laterale: anello imidazolico) appartenente alla catena polipeptidica a cui è associato l’eme.
• Sesta posizione di coordinazione (sopra il piano dell’anello) → con la molecola di ossigeno.

Istidina da un lato e dall’altro l’ossigeno. ↳

Presenza dell’ossigeno → influenza il legame tra il Fe²⁺ e la porfirina.

Ossigeno può esserci ma può anche non esserci nella sesta posizione di coordinazione. ↳

→ Ossigeno non c’è (es. deossimioglobina e deossiemoglobina): Fe²⁺ fa solo 5 legami di coordinazione e in queste condizioni lo ione ferro è piuttosto voluminoso in senso di raggio ionico ed è troppo grande per stare perfettamente al centro dell’anello tetrapirrolico → sembra essere leggermente fuori dal piano un po’ verso il basso = lieve deformazione su tutto l’eme, disassamento tra il piano e lo ione ferroso (0,4 A).

→ Si lega l’ossigeno ione ferro rimane sempre 2+ ma riassetto degli elettroni al suo interno e il raggio ionico diminuisce = si riposiziona perfettamente al centro del piano porfirinico, conseguenze fondamentali sull’istidina ↳ che si sposta insieme al ferro portandosi dietro la catena polipeptidica.

Legame del ferro → responsabile di una piccola modifica conformazionale.

fMRI: (risonanza magnetica funzionale per immagini) consente di studiare le zone del cervello in cui viene consumato ossigeno, zone particolarmente attive.

Laddove l’ossigeno si lega all’eme del sangue che arriva a queste zone del cervello vengono ↳ modificate le proprietà magnetiche dei nuclei di H presenti nelle molecole di acqua che circondano le molecole di emoglobina → possibile mettere in evidenza molecole di acqua che appaiono opportunamente colorate.

Ruolo catena polipeptidica

Eme = struttura idrofoba → quando l’eme è libero lega l’ossigeno e tende a formare dei ↳ dimeri eme-O-eme, che non si formerebbero con la catena polipeptidica → provocano la ossidazione irreversibile del ferro con riduzione parziale della molecola di ossigeno ad anione superossido.

Con catena polipeptidica ci può essere il trasferimento di un elettrone da Fe²⁺ all'O legato e ↳ si può formare transitoriamente una situazione del tipo Fe³⁺ con legato un anione superossido ma nel momento in cui l’ossigeno viene rilasciato si torna alla condizione normale con Fe²⁺ → catena polipeptidica fondamentale: impedisce la dimerizzazione dell’eme e l’ossidazione irreversibile del ferro da Fe²⁺ a Fe³⁺.

→ Ossigeno legato a un altro residuo di istidina (istidina distale, E7).

Zona dove è legato l’ossigeno = delimitata da residui idrofobi che formano una tasca e proteggono dai fenomeni ossidativi.

Eme oltre a legare l’ossigeno potrebbe anche legare molecole alternative pericolose (es. ↳ monossido di carbonio, CO = veleno → affinità per il ferro dell’eme elevatissima, molto più dell’ossigeno).

Eme libero → costante di dissociazione (Kd, più alta è tale costante più bassa è l’affinità) per il monossido di carbonio è 20000 volte più bassa di quella dell’ossigeno → ligando, quando l’eme è libero, si lega con una geometria perfettamente perpendicolare al piano dell’eme = bastano tracce minime di CO per andare a spiazzare tutto l’ossigeno sull’eme.

Catena polipeptidica che avvolge l’eme fa sì che il ligando non si leghi con una geometria ↳ perfettamente perpendicolare ma con angolo di circa 120 gradi, perché l’istidina distale crea un ingombro sterico sopra il piano dell’eme e il ligando (CO o O₂) si lega con una geometria angolata (l’ossigeno interagisce con l’istidina distale mentre il monossido di carbonio no) → cambiano le costanti di dissociazione, CO rimane comunque più affine ma solo di 40 volte (si riduce di 500 volte) e quindi quelle piccole produzioni fisiologiche di CO non hanno alcun effetto sul trasporto della emoglobina.

Negli artropodi → sistemi di trasporto dell’ossigeno si basano sulla presenza di ioni rame, molteplici catene di istidina coordinano legami con gli ioni rame e si formano dimeri con l’ossigeno messo a ponte.

Mioglobina

Catena polipeptidica di 153 amminoacidi con un peso molecolare di circa 16700 u.m.a., ↳ proteina tutta α.

→ Struttura secondaria: costituita da solo α-eliche, collegate tra loro da delle zone loop (anse), α eliche: 8, denominate a partire dall’estremità N-terminale della catena, dalla “A” alla “H”.

→ Zone di collegamento: denominate in base alle eliche che collegano, ad esempio, il tratto (o ansa) “AB”, collega l’elica A all’elica B.

Istidina prossimale “F8” → lega il gruppo EME ed è l’ottavo residuo dell’elica F, che nel caso della mioglobina corrisponde all’amminoacido 93 della catena polipeptidica.

“Istidina E7” → Istidina distale, settimo residuo della quinta elica.

Mioglobina = proteina intracellulare, si trova all’interno delle cellule muscolari, nelle fibre muscolari di tipo 1, lente e rosse (caratteristica data proprio dalla mioglobina), e in misura minore anche nelle fibre di tipo 2A, rapide e rosse → fibre muscolari classificate in base alla loro struttura in tre tipi: 1, 2A e 2B, quest’ultime sono ultrarapide e non hanno la mioglobina (colore bianco).

Presente nel miocardio → cellule del muscolo cardiaco sono rosse, ricche di mioglobina. ↳ Presenza di questa proteina testimonia che svolgono fondamentalmente un metabolismo aerobico, e che hanno bisogno di riserve di ossigeno (legato alla mioglobina).

In grandi quantità nei cetacei → permette di fare immersioni molto lunghe senza respirare.

Funzione: immagazzinare ossigeno → EME posizionato in una tasca che si forma nella catena polipeptidica.

Legame con l'ossigeno

All’EME della mioglobina, ↳ → ossigeno può essere legato nella ossimioglobina (MbO₂), o non legato → mioglobina non ossigenata = deossimioglobina (Mb).

Equilibrio di ossigenazione reversibile: ogni molecola di mioglobina non ossigenata, che contiene il gruppo EME, può legare una ↳ molecola di ossigeno per formare, in maniera reversibile, una molecola di ossimioglobina.

Costante di dissociazione Kd (inverso costante di associazione Ka e costante di equilibrio): indica quanto è affine la mioglobina all’ossigeno: valori bassi di Kd indicano un'elevata ↳ affinità, alti valori di Kd indicano invece bassa affinità.

Concentrazione della mioglobina ossigenata.

Frazione di saturazione (Y o θ) = frazione dei siti di legame dell’ossigeno sulla mioglobina che sono effettivamente occupati da ossigeno.

Ci dice quanto è ossidata la mioglobina rispetto al totale. ↳

Valore può oscillare da un minimo di 0 ad un massimo di 1, 0 quando non c’è nemmeno una molecola di mioglobina ossigenata mentre 1 quando la mioglobina è tutta completamente ossigenata. 1 = mioglobina satura di ossigeno.

A volte nei grafici valore espresso in percentuale, che oscilla da 0 a 100%.

Saturazione della mioglobina in funzione della quantità di ossigeno disponibile nel mezzo.

Frazione di saturazione: ↳ si tratta di un gas, dobbiamo considerare l’ossigeno in pressione parziale, e non la ↳ concentrazione molare.

Grafico: variabile dipendente = frazione di saturazione Y, in funzione della variabile indipendente = pressione parziale di ossigeno pO₂.

Funzione matematica che descrive la funzione corrisponde = iperbole, che tende poi ad un asintoto (livello di saturazione massima di ossigeno) → si raggiunge a valori di pressioni parziali di ossigeno infinitamente elevati.

Dall’origine degli assi con valori pari a 0, aumentando la pO₂ la saturazione sale rapidamente; segue una curva e poi tende verso l’asintoto.

Se supponiamo che la Kd abbia le dimensioni di pO₂. Riprendiamo la relazione in giallo e sostituiamo la Kd, otteniamo pO₂.

Ridefiniamo Kd → valore di pressione parziale di ossigeno in presenza del quale noi abbiamo metà delle molecole di mioglobina legate all’ossigeno e l’altra metà non legata; in cui si ha la emi-saturazione, indicato genericamente come P50. → nel caso della mioglobina questo valore è pari a 2 Torr (coincide con 2mmHg), ed è molto basso. Kd così bassa → indicativa di una affinità molto elevata, appena la mioglobina vede l’ossigeno lo lega.

Grafico: valore di riferimento 5 Torr, valore di pO₂ all'interno di una cellula muscolare.

Quando lavora intensamente la pO₂ scende rapidamente, a quel ↳ punto la mioglobina libera l’ossigeno che ha legato e lo mette a disposizione delle funzioni metaboliche della cellula. Mioglobina → può svolgere le sue funzioni in queste condizioni perché la pressione parziale di ossigeno del mezzo è molto simile al suo valore P50.

Grafico: consideriamo mioglobina come proteina trasportatrice nel sangue, notiamo, riportando i valori di pO₂ nel sangue (arterioso e venoso), che le condizioni permettono il rilascio di ossigeno solo all’8%.

Mioglobina è così affine che non permetterebbe alcun rilascio, è ↳ la proteina trasportatrice di ossigeno nelle cellule muscolari, dove la pressione parziale di ossigeno è molto più bassa.

Sede fisiologica della mioglobina: all’interno delle cellule striate, quelle rosse, in circolo non ci dovrebbe essere → se qualcuno dopo uno sforzo fisico si misura la mioglobina in circolo, la trova a livelli molto alti, oppure dopo un infarto del miocardio (comune infarto del cuore).

La mioglobina può trovarsi in circolo, ma solo dopo un danno cellulare a quelle cellule che ↳ contengono mioglobina → in entrambi i casi è la stessa non possiamo utilizzarla come marcatore di patologia, non c’è specificità di sede.

→ Diversi tessuti producono proteine con la stessa funzione ma leggermente diverse (isoforme) → accade spesso con gli enzimi.

Altre globine

Altre globine: neuroglobina e citoglobina → struttura assomiglia alla mioglobina.

→ Neuroglobina si trova nei neuroni sia del sistema nervoso centrale che del sistema nervoso periferico, nella retina, in certe cellule neuroendocrine.

Funzione: immagazzinare ossigeno e proteggere dall’ipossia questi tessuti, dalla quale sono molto sensibili → neuroni hanno un metabolismo esclusivamente aerobico, non possono assolutamente andare in ipossia, non come le cellule muscolari scheletriche che in assenza di ossigeno possono tranquillamente lavorare producendo lattato.

Deposito che protegge dalla condizione di ipossia. ↳

→ Citoglobina un po’ dappertutto, più ubiquitaria.

Funzione: non ancora chiarita, protegge anche questa dall’ipossia ma siccome è presente anche in tessuti che non hanno bisogno di essere più di tanto protetti dall’assenza di ossigeno, funzione di “scavenging”, in grado di legare le specie reattive dell’ossigeno che potrebbero essere dannose per la cellula (es. anione superossido).

Hanno in comune la peculiarità, sono esa-coordinate in tutte le condizioni, sia in presenza ↳ che in assenza di ossigeno, la sesta posizione è occupata, in assenza di ossigeno, dall’Istidina distale, che si comporta come l’istidina prossimale e forma un legame diretto con il Fe²⁺ → quando arriva il ferro abbiamo due passaggi, prima si stacca l’Istidina distale e poi si lega l’ossigeno.

Istidina prossimale si lega al ferro al di sotto del piano dell’EME, e l’Istidina distale che sta sopra e, essendo molto vicina al ferro, è coordinata anche lei. Nella catena polipeptidica della neuroglobina l’istidina prossimale è la numero 96 ma comunque sempre l’Istidina F8.

Il valore della P50 è pari a 1 Torr → affinità elevatissima per l’ossigeno → la funzione di protezione dall’ipossia si mette in moto solo quando la pO₂ è ai minimi termini.

Curiosità sulla neuroglobina e monossido di carbonio

Curiosità sulla neuroglobina (bisogna parlare un attimo del monossido di carbonio).

CO = veleno talmente importante che la metà tra tutti gli avvelenamenti noti è data proprio da lui → si lega sia all’emoglobina che alla mioglobina, problema grosso nel primo caso, perché l’emoglobina lega l’ossigeno e lo trasporta in circolo, e forma la carbossiemoglobina.

Formata questa non si lega più l’ossigeno, solo il CO. ↳

Avvelenamento da monossido di carbonio, ci deve essere nell’ambiente, ad esempio:

• Caldaia o una stufa difettosa (combustione in difetto di ossigeno, si forma CO e non CO₂).
• Tentativi di suicidio, uno si rinchiude in un garage con il motore acceso, il CO uccide.
• Nei fumatori, percentuale di carbossiemoglobina è tra il 3 e il 15%, contro l’1% di un non fumatore.

Sintomi dell’avvelenamento compaiono quando la carbossiemoglobina supera il 20%, sono ↳ cefalea, nausea, capogiro, confusione, vertigini, dispnea fino a perdita di coscienza, coma, e nei casi più gravi, m