Schemi biochimica II - parte II

Il legame con la biotina

C'è il legame con cui si è formato il legame con la biotina e poi c'è la catena di biotina e infine l'anello della biotina. La catena funziona da braccio molecolare; la sua presenza è importante perché l'enzima deve spostare lo ione bicarbonato al substrato affinché questo si leghi lì. Il bicarbonato si lega all'atomo di azoto in rosso dell'anello.

Catalisi enzimatica

Rappresentazione e funzione

Rappresentazione schematica 3D di un enzima: superficie ampia, in periferia esposte le catene laterali di amminoacidi idrofili. Zona rossa, molto piccola, che si trova in una depressione e rappresenta il sito attivo, regione della superficie enzimatica in cui si va a legare il substrato ed in cui avviene la trasformazione del substrato.

Residui amminoacidi che parteciperanno alla catalisi non necessariamente vicini nella sequenza amminoacidica perché ho un ripiegamento tridimensionale della molecola. Guardando il backbone, amminoacidi colorati rappresentano quelli che entrano nel sito attivo, formano una tasca su cui si inserisce il substrato.

Svolgendo la catena e riportandola in forma primaria, residui possono essere anche molto lontani in sequenza: ripiegamento tridimensionale della catena che fa sì che questi amminoacidi siano vicini e formino la tasca in cui si inserisce il substrato.

Meccanismo d'azione

In alto molecola di un ipotetico substrato, in basso un enzima: nell'enzima esiste regione cava, una depressione, che ha una forma complementare rispetto al substrato. Il substrato si va a posizionare all'interno di questa cavità e tra il substrato e il sito di legame del substrato dell'enzima (non necessariamente coincidente con il sito attivo dell'enzima perché si può avere cambiamento conformazionale) si creano una serie di interazioni favorevoli.

Zone idrofobe entrano a contatto con zone altrettanto idrofobe del sito attivo; NH entra a contatto con l'ossigeno elettronegativo e si forma un legame a idrogeno; carica negativa del substrato entra a contatto con una carica positiva eventualmente presente nel sito attivo, si stabilisce un'interazione ionica.

Nel momento in cui il substrato si lega all'enzima, nel sito attivo dell'enzima si stabiliscono una serie di interazioni non covalenti (interazioni deboli: idrofobiche o di tipo polare come interazioni ioniche, dipolo-dipolo) e si osserva come sembra che esista una complementarità totale, da un punto di vista della conformazione, tra la molecola del substrato e il sito attivo dell'enzima (in realtà non è proprio così).

Esempio: enzima ribonucleasi

Es. enzima ribonucleasi idrolasi con funzione di scindere idroliticamente l'acido ribonucleico: nel sito attivo può andare a finire un pezzetto di RNA, per esempio una base azotata di uracile, ed essa interagisce in modo molteplice, in questo caso attraverso legami di tipo ionico, almeno su tre posizioni. Substrato si va a collocare nel sito attivo si stabiliscono delle interazioni complementari, numerose, tante deboli che poi alla fine diventano interazioni rilevanti.

Teorie del legame enzima-substrato

Alla fine dell'800, Fischer, che aveva studiato l'appartenenza alla serie D alla serie L dei vari isomeri ottici, elaborò una teoria secondo cui fra substrato e sito attivo dell’enzima doveva esistere complementarità strutturale simile a quella che corre fra una chiave e la sua serratura, dove la chiave è il substrato e la serratura è l'enzima. Se la chiave non apre quella serratura, vuol dire che la chiave è sbagliata e serve quindi quella precisa. Questo concetto può essere esteso al substrato e all'enzima, cioè l’enzima riconosce il suo substrato: molecole che sono abbastanza diverse dal substrato non si legano all'enzima.

La teoria chiave-serratura in cui si postulava una complementarità totale tra enzima e substrato, però non ha retto all'evidenza dei fatti e dopo qualche decennio è venuta meno (teoria che prevede che ci sia una forte rigidità e una forte interrelazione strutturale fra substrato ed enzima).

Teoria dell'adattamento indotto

Alla fine degli anni '50 è stata proposta una nuova teoria, la teoria dell'adattamento indotto, che prevede che il substrato non abbia una complementarità totale all’inizio con il sito attivo dell'enzima, ma che quando il substrato si lega al sito attivo dell'enzima si ha un adattamento strutturale che viene indotto dal legame del substrato stesso e quindi si stabiliscono le interazioni che avevamo visto prima anche nella teoria chiave-serratura.

Non appena si forma il complesso enzima-substrato (ES) anche il substrato comincia a modificarsi: l'affinità del sito attivo dell'enzima non è tanto per il substrato come tale, quanto per una forma leggermente diversa del substrato, chiamata stato di transizione.

Energia di attivazione

Descrizione qualitativa di ciò che accade a livello del sito attivo. Grafico che illustra l'andamento dell'energia nel corso di una reazione.

• Asse y: energia libera
• Asse x: “coordinata di reazione” che illustra i tempi dello svolgimento della reazione.

All'inizio il substrato (reagente) ha un certo livello energetico, indicato dalla linea tratteggiata, in corrispondenza di S (substrato). Al termine, P (prodotto) ha un'energia più bassa rispetto a quella del substrato. La differenza di energia presente tra il prodotto e il substrato è il ΔG, la variazione di energia libera di Gibbs della reazione.

Un prodotto con energia libera inferiore rispetto al reagente (substrato) indica una variazione di energia libera negativa e la reazione è termodinamicamente spontanea (esoergonica). Se il prodotto fosse energeticamente più in alto rispetto al substrato, la differenza di energia libera sarebbe stata positiva e la reazione non si sarebbe potuta svolgere, risultando impossibile da un punto di vista termodinamico, a meno che non si fosse fornita energia dall'esterno (endoergonica, richiede energia per potersi svolgere).

Durante lo svolgimento della reazione si forma un complesso attivato (o stato di transizione), che non è più il substrato di partenza, ma non è ancora neanche il prodotto di arrivo. Questo sta a metà strada da un punto di vista strutturale. È la specie che ha la maggiore energia durante la reazione ed è fortemente instabile: si forma solo in modo transitorio, ma è necessario passarci attraverso, altrimenti la reazione non si può svolgere. Il substrato, prima di trasformarsi in prodotto, deve passare attraverso lo stato di transizione assumendo delle caratteristiche strutturali che lo rendono particolarmente instabile (ad energia elevata).

La differenza di energia tra il substrato e lo stato di transizione (prima freccia rossa) rappresenta la barriera energetica da cui dipende la velocità della reazione: è l'energia di attivazione.

Reazioni catalizzate

ΔG_S→P è l’energia di attivazione della reazione diretta, quella che va dal substrato verso il prodotto. Più è grande la distanza tra substrato e stato di transizione, più è lenta la reazione. Esiste una relazione inversa tra velocità della reazione ed energia di attivazione della reazione.

Nell'equazione della velocità di reazione c'è anche una costante k, costante di velocità, derivante dall'equazione di Arrhenius. La costante di velocità aumenta all'aumentare della temperatura e diminuisce all'aumentare dell'energia di attivazione. Dal momento che la velocità della reazione ha sempre una sua costante di velocità, è tanto più grande quanto maggiore sarà la velocità.

In chimica c'è una correlazione diretta tra la velocità della reazione e la temperatura e una correlazione inversa tra velocità della reazione ed energia di attivazione. In altre parole, più la temperatura è elevata più la reazione è rapida, perché le molecole si muovono molto più velocemente e la probabilità che queste molecole interagiscano tra loro e possano reagire aumenta se il moto termico è maggiore; invece, l'energia di attivazione ha una correlazione inversa.

Il ruolo del catalizzatore

Un catalizzatore agisce sullo stato di transizione, senza toccare né l'energia del substrato né l'energia del prodotto: rimangono le stesse. La termodinamica del processo non si modifica, la variazione di energia libera di Gibbs della reazione rimane la stessa anche in presenza del catalizzatore, e l'equilibrio della reazione non si modifica.

Quello che cambia è la velocità della reazione, con cui il substrato si trasforma in prodotto; ma anche con cui il prodotto torna a essere substrato (energia di attivazione della reazione inversa: freccia più alta, più grande, sulla destra del grafico). L'azione enzimatica consiste nel rendere la traccia scura della reazione non catalizzata una traccia azzurra della reazione enzimatica (catalizzata dall'enzima).

Il substrato deve prima legarsi all'enzima per formare il complesso ES (enzima-substrato), che non è più stabile del substrato. Se ci fosse stato un legame immediatamente complementare, forte, diretto, del substrato come tale e il sito attivo dell'enzima, avremmo avuto un complesso ES ad energia molto più bassa. Questo ci permette di comprendere il motivo per cui la teoria di Fisher non ha tenuto.

È come se il substrato si destabilizzasse legandosi all'enzima. Successivamente si va veramente verso lo stato di transizione, fortemente stabilizzato. La vetta della curva sotto la doppia crocetta azzurra è molto più in basso rispetto a quella non catalizzata; il substrato trasformato in prodotto, forma il complesso enzima-prodotto che si scinde liberando il prodotto e l'enzima libero pronto per fare un nuovo ciclo di catalisi.

La variazione dell'energia di attivazione della reazione catalizzata è molto più piccola rispetto all'energia di attivazione della reazione non catalizzata: la presenza del catalizzatore ha diminuito l'energia dello stato di transizione, quindi l'energia di attivazione, rendendo la reazione più veloce.

In presenza di un catalizzatore, è ridotta l’energia di attivazione della reazione diretta ma anche l’energia di attivazione della reazione inversa; equilibrio non modificato, rimane lo stesso, ma viene raggiunto più velocemente: tempo per raggiungere l'equilibrio più basso.

Molecole e stabilizzazione

Nel sito attivo avviene la catalisi perché:

• Stabilizzato lo stato di transizione della reazione (per definizione instabile = ad alta energia, nel sito attivo dell'enzima durante la catalisi, perde energia, ed è più stabile).
• Espulsione delle molecole di acqua quando il substrato si lega al sito attivo dell'enzima; molecole idrofile polari sono circondate da uno strato di molecole d'acqua (strato di idratazione o solvatazione) che concorre a stabilizzare la struttura del substrato quando è libero; substrato entra nel sito attivo, molecole d'acqua vengono espulse e il substrato si destabilizza, si deve trasformare.
• Gruppi chimici reattivi che concorrono a facilitare la trasformazione.
• Può essere presente (non necessariamente) un coenzima, un cofattore, uno ione metallico, un cofattore metallico o una molecola di natura organica, che partecipa alla catalisi facilitando la trasformazione del substrato.

Reazione non catalizzata

Substrato uguale a una barretta di metallo e prodotto della reazione uguale a due frammenti che si ottengono dallo spezzettamento della bacchetta (si frammenta in due parti). Stato di transizione potrebbe essere la bacchetta piegata: difficile da formare, ma una volta che si è formata poi è abbastanza semplice che questa si spezzi.

In assenza di enzima profilo energetico della reazione è quello classico: un certo valore di energia di attivazione che è dato dalla differenza tra l'energia libera del substrato e l'energia dello stato di transizione. Se la teoria di Fischer fosse vera, cioè se il substrato avesse perfetta complementarità per il sito attivo dell'enzima rappresentato come una cavità dove sono presenti dei “piccoli magneti”, che attraggono la barretta metallica e la rendono ancora più stabile, allora il profilo energetico (complesso enzima-substrato) avrebbe un livello energetico molto più basso rispetto al substrato libero perché lì la barretta è protetta da questo ambiente che forma una specie di astuccio attorno ad essa. Viene stabilizzata la sua struttura da questi legami con il sito attivo dell'enzima e l'energia del complesso ES è molto bassa, portando a un ulteriore rallentamento della reazione.

Tuttavia, la realtà è diversa: il sito attivo dell'enzima ha affinità per il substrato, perché la barretta si va a legare dentro, però ha molta più affinità, con i dovuti aggiustamenti, allo stato di transizione, che è la barretta piegata. È lo stato di transizione a essere stabilizzato dal contatto con il sito attivo dell'enzima e non il substrato.

Substrato: nel formare il complesso ES rimane lì come energia. Si formano delle nuove interazioni all'estremità della bacchetta diritta, però magari questa ha dovuto espellere le molecole di acqua; quindi, da un lato si è destabilizzata per l'espulsione dell'acqua e dall'altro ha recuperato parte di questa energia conformazionale formando queste interazioni con il sito attivo. L'energia del complesso enzima-substrato è più o meno la stessa di quella del substrato libero; cambia che, nel momento in cui si forma il complesso attivato, lo stato di transizione si è stabilizzato ed è decisamente più facile che la bacchetta poi si spezzi rapidamente.

Meccanismi di catalisi

Tipologie di catalisi

I meccanismi di catalisi consentono lo svolgimento della catalisi:

• I. Catalisi di prossimità: estremamente generica
• II. Catalisi acido-base
• III. Catalisi covalente
• IV. Catalisi da metallo

Queste tipologie di catalisi non si escludono mutuamente, possono coesistere: un enzima può utilizzare diversi di questi meccanismi.

Catalisi enzimatica di prossimità

Prossimità significa avvicinamento del substrato al sito attivo o, se i substrati sono due, avvicinamento dei substrati tra loro. I substrati possono portare, entrando nel sito attivo, i loro gruppi reattivi in contatto; assumere orientamento corretto.

Lo stato di transizione può essere stabilizzato in vario modo dalla prossimità fra gruppi chimici diversi: carica elettrica che si genera sul substrato può essere distribuita su più atomi (stabilizzazione, basti pensare alla delocalizzazione elettronica negli anelli aromatici).

Molecole, anche le più semplici, quando possiedono atomi legati da legami semplici, vi sono dei movimenti di rotazione attorno al legame: movimenti rotazionali responsabili di un certo livello di entropia. Entrando nel sito attivo, movimenti rotazionali attorno ai legami possono cessare perché c'è una costrizione sterica e questo fa sì che la reazione avvenga più facilmente: riduzione entropica.

Riduzione dell'entropia, aumento dell'ordine: facilita la reazione. Movimenti rotazionali si bloccano, ordine cresce, entropia diminuisce, rendendo più facile avere la reazione. I substrati tendono a perdere il loro strato di idratazione (desolvatazione).

Catalisi enzimatica acido-base

Il trasferimento di protoni (ioni H⁺) tra l’enzima e il substrato avviene in entrambe le direzioni: ci può essere catalisi acida quando lo ione H⁺ viene ceduto, per esempio, dall'enzima; oppure catalisi basica quando lo ione H⁺ viene acquistato.

La catalisi acido-base può essere:

• Specificamente quando la cessione o l'acquisizione di ioni H⁺ avviene grazie alla presenza di ioni idronio H₃O⁺ o ioni OH^- (ossidrile), derivanti dalla dissociazione della molecola di acqua.
• Generalmente quando operano le catene laterali degli amminoacidi che hanno una catena ionizzabile ed esistono in una forma acida, come nel caso di glutammato e aspartato (R—COOH): forma protonata, quando l'aminoacido è libero, la si ritrova solamente a valori di pH molto bassi; più spesso si trova nella forma deprotonata (R—COO^-).

Può accadere nel sito attivo di un enzima che si creino le condizioni per cui un gruppo carbossile sia protonato (gruppo carbossile dell’aspartato o del glutammato).

Esempio: pepsina

Es. pepsina è un enzima proteolitico digestivo presente nel succo gastrico, a livello del sito catalitico due residui acidi: aspartato e glutammato. Per poter funzionare, uno deve essere in forma COO^- e l'altro in forma COOH. La pepsina non agisce dentro le cellule o nell'ambiente extracellulare; agisce nello stomaco, ambiente con grande abbondanza di acido cloridrico che rende il pH piuttosto acido e per questo ha ragione di esistere un gruppo carbossile COOH dell’aspartato.

Lo stesso discorso vale per lisina e arginina che si trovano in forma protonata oppure deprotonata. Per la forma deprotonata (NH₂) bisogna stare a valori di pH elevati (10, 11, 12). I residui che possono protonare o deprotonare intorno alla neutra.