Riassunto esame Biologia e genetica, Prof. Bersanelli Marco, libro consigliato Biologia molecolare, Alberts

REPLICAZIONE DEL DNA

Concetti  generali    

Lo   scopo   della   replicazione   del   DNA   consiste   nel   copiare   l’intero   genoma   senza   commettere  

errori  svolgendo  il  processo  una  sola  volta  per  ciclo  cellulare.  Le  cellule  eucariotiche,  infatti,  

devono  coordinare  la  proliferazione  e  il  differenziamento  durante  lo  sviluppo.  La  replicazione  

avviene   durante   la   fase   S   del   ciclo   cellulare   e   comincia   in   diversi   punti   su   un   cromosoma,  

chiamati  origini  della  replicazione.  Nei  procarioti  l’origine  della  replicazione  è  unico,  mentre  

negli   eucarioti   ve   ne   sono   migliaia.   Gli   eucarioti,   a   differenza   dei   procarioti,   devono   affrontare  

il   problema   dell’accessibilità   al   DNA,   perché   questo   è   compattato   nella   cromatina,   e   devono  

mantenere  attiva  l’espressione  di  certi  geni  essenziali  per  il  differenziamento  cellulare.  Inoltre  

negli   eucarioti   si   presenta   il   problema   del   mantenimento   delle   informazioni   sui   terminali  

cromosomici,  i  telomeri,  visto  l’impedimento  molecolare  della  polimerasi  nel  replicarli.    

Concetto   della   semiconservazione   del   DNA:   quando   la   molecola   di   duplica,   i   due   filamenti  

prodotti  sono  formati  ognuno  da  metà  del  filamento  parentale  e  da  un  filamento  di  neosintesi.  

Inoltre,  la  replicazione  del  doppio  filamento  è  bidirezionale:  si  vengono  a  formare  due  forche  

di   replicazione   che   allargano   la   bolla   replicativa   e   consentono   in   maniera   semiconservativa   di  

dare   origine   a   due   molecole   di   DNA,   ognuna   delle   quali   è   formata   da   un   filamento   di  

neosintesi  e  da  uno  parentale.    

L’enzima   responsabile   della   replicazione   si   chiama   DNA   polimerasi,   ve   ne   sono   cinque   nei  

procarioti  e  nove  negli  eucarioti,  hanno  funzioni  diverse  ma  caratteristiche  condivise:  per  la  

loro  azione  necessitano  di  un  filamento  di  RNA  che  funge  da  primer  d’innesco  della  reazione  

di  polimerizzazione  e  di  una  sequenza  di  DNA  a  singolo  filamento  che  costituisce  lo  stampo  e  

da   cui   l’enzima   è   in   grado   di   polimerizzare   il   filamento   di   neosintesi.   Oltre   a   queste  

caratteristiche   fondamentali   della   polimerasi,   questi   enzimi   necessitano   di   un   substrato   che  

viene  incorporato  durante  la  sintesi,  i  nucleotidi  trifosfato.  L’operazione  di  polimerizzazione  

richiede   energia,   fornita   dall’idrolisi   dello   stesso   substrato   che   viene   incorporato   durante   la  

neosintesi   del   filamento   complementare:   in   particolare,   l’enzima   polimerasi   è   in   grado   di  

introdurre  opportunamente,  leggendo  la  sequenza  stampo  e  basandosi  su  un  meccanismo  di  

appaiamento   specifico   tra   basi   complementari,   un   legame   fosfodiestero   tra   il   3’   OH  

dell’innesco   e   il   fosfato   in   posizione   alfa   del   deossinucleotide   entrante.   Questa   reazione   di  

formazione   del   legame   è   simile   all’attacco   nucleofilo   dei   ribozimi   (l’ossidrile   viene  

deprotonato,  si  forma  un  ossianione  che  è  in  grado  di  dare  un  attacco  nucleofilo  al  fosfato  e  

quindi   formare   un   legame   fosfodiestereo).   Durante   la   reazione,   il   fosfato   beta   e   il   fosfato  

gamma   vengono   rilasciati;   ciò   che   dà   energia   a   questa   reazione   è   proprio   l’idrolisi   del   legame  

fosfodiestero   tra   il   fosfato   beta   e   il   fosfato   gamma   che   è   operato   dall’enzima   pirofosfatasi.   La  

reazione   di   polimerizzazione,   che   è   estremamente   rapida,   diventa   irreversibile   grazie  

all’idrolisi  del  pirofosfato  rilasciato  dopo  la  formazione  del  legame  fosfodiestereo  tra  l’innesco  

e  il  nucleotide  entrante.    

La   struttura   della   DNA   polimerasi,   che   è   conservata   tra   procarioti   ed   eucarioti,   è  

rappresentabile  come  una  mano  destra,  in  cui  si  distinguono  tre  zone.    

  La   zona   del   palmo   contiene   il   sito   catalitico   dove   avviene   la   reazione   di  

• polimerizzazione.   In   questa   regione   lo   stampo   e   l’innesco   vengono   a   trovarsi   vicini.  

Inoltre  il  palmo  contiene  anche  un  sito  con  attività  di  correzione  di  bozze,  quindi  con  

attività   esonucleasica   (in   grado   di   degradare   il   DNA   nel   senso   3’-­‐5’,   al   contrario   di  

come   viene   sintetizzato,   quindi   5’-­‐3’),   per   rimuovere   l’introduzione   di   un   nucleotide  

non  corretto.    

La  zona  del  pollice:  il  pollice  ha  la  funzione  di  assicurare  processività  alla  polimerasi.  

• Fa  in  modo  che  la  DNA  polimerasi  rimanga  abbastanza  stabilmente  legata  al  DNA  che  

sta  sintetizzando,  perché  altrimenti  l’enzima  tenderebbe  a  staccarsi.    

La  zona  delle  dita:  la  funzione  delle  dita  è  di  chiudersi  stabilizzando  il  mantenimento  

• del   nucleotide   entrante   nella   posizione   corretta   per   la   polimerizzazione.   Quando   il  

nucleotide   si   appaia   correttamente   al   suo   stampo   e   quindi   genera   la   geometria  

corretta,   un’alfa-­‐elica   delle   dita   si   chiude   e   grazie   a   un   residuo   di   tirosina   si   formano  

delle   interazioni   idrofobiche   con   le   basi   che   tendono   a   mantenere   il   nucleotide   nella  

posizione   di   sintesi.   Un   altro   importante   ruolo   delle   dita   è   dare   una   curvatura   allo  

stampo  durante  la  sintesi:  il  nucleotide  successivo  a  quello  che  funge  da  stampo  viene  

estruso  dal  sito  catalitico  evitando  in  tale  maniera  che  non  ci  sia  un’incorretta  lettura  

dello  stampo  dovuta  alla  presenza  simultanea  nel  sito  catalitico  di  due  nucleotidi.    

Il   sito   catalitico,   situato   sul   palmo   della   mano,   è   composto   essenzialmente   da   una   serie   di  

aminoacidi,  come  il  glutammato  e  l’aspartato,  che  legano  due  ioni  metallici  bivalenti,  come  il  

magnesio  o  il  manganese.  Questi  ioni,  chiamati  A  e  B,  legati  rispettivamente  a  due  residui  di  

aspartato,   hanno   funzioni   separate,   perché   lo   ione   A   deprotona   l’ossidrile   presente   al   3’  

dell’innesco,   e   quindi   forma   l’ossianione   per   l’attacco   nucleofilo   sul   fosfato   alfa   del   nucleotide  

entrante  (ciò  può  accadere  perché  il  legame  di  coordinazione  con  l’aspartato  rende  lo  ione  più  

elettronegativo  e  fa  in  modo  che  venga  attratto  l’idrogeno  presente  sull’ossidrile  al  3’);  lo  ione  

B   interagisce   con   i   gruppi   fosfato   beta   e   gamma   del   nucleotide   entrante,   orientandoli  

adeguatamente   a   livello   del   sito   catalitico.   C’è   inoltre   bisogno   di   una   modalità   per  

discriminare  i  ribonucleotidi  dai  deossiribonucleotidi,  che  sono  dieci  volte  meno  concentrati  

dei   primi.   Per   questo,   dal   punto   di   vista   cinetico,   l’enzima   tenderebbe   ad   assumere   i  

ribonucleotidi   piuttosto   che   gli   altri:   il   meccanismo   di   discriminazione   è   formato   da   una   serie  

di  aminoacidi  posti  nel  palmo  della  mano  in  grado  di  discriminare  gli  zuccheri  e  in  particolare  

i   deossiribonucleotidi   rispetto   ai   ribonucleotidi,  perché   riconoscono   la   presenza   dell’ossidrile  

in  2’.  Nel  caso  della  DNA  polimerasi  l’affinità  per  i  ribonucleotidi  è  molto  più  bassa  che  per  i  

deossiribonucleotidi.  La  capacità  della  polimerasi  di  introdurre  il  nucleotide  corretto  è  dovuta  

al   mantenimento   della   corretta   geometria   di   Watson   e   Crick   per   quanto   riguarda   la   forma   del  

DNA.  Quando  viene  casualmente  introdotto  un  nucleotide  non  complementare  a  quello  dello  

stampo,   si   viene   a   formare   una   geometria   incorretta   tra   le   copie   di   basi   per   cui   i   parametri  

termodinamici  e  fisico-­‐chimici  che  distinguono  la  forma  B  del  DNA  risultano  alterati  e  fanno  in    

modo   che   la   polimerasi   si   blocchi   e   impedisca   la   possibilità   di   formare   il   legame  

fosfodiestereo.   Nel   caso   in   cui   venga   introdotto   il   nucleotide   scorretto,   ciò   consente   alla  

polimerasi   si   tornare   indietro   e   rimediare   all’errore.   La   corretta   geometria   consente   una  

distanza  ottimale  tra  l’ossianione  dell’innesco  e  il  fosfato  in  alfa.    

Molti   farmaci   che   vengono   utilizzati   in   terapia,   sia   antivirale   sia   antitumorale,   sono   dei  

nucleotidi  modificati  che  causano  errori  nella  replicazione:  ci  sono  due  categorie  importanti  

che   agiscono   con   un   meccanismo   che   dà     un   risultato   finale   simile,   l’alterazione   della  

replicazione   e   l’introduzione   errori   che   danneggiano   il   DNA.   Questo   danneggiamento   si  

traduce   in   segnali   di   morte   cellulare   programmata.   Si   ricordano   gli   antimetaboliti,   o  

terminatori   di   catena   come   l’aciclovir   che   si   usa   per   il   virus   HIV:   essi   danno   il   blocco   della  

replicazione   perché   impediscono   alla   polimerasi   di   procedere,   in   quanto   mancano  

dell’ossidrile  in  3’.  Gli  analoghi  dei  precursori  nucleotidici,  invece,  come  il  5-­‐fluoro  uracile  e  la  

6-­‐mercapto   purina,   bloccano   la   replicazione,   perché   danno   una   deplezione   della   sintesi   dei  

precursori  nucleotidici  necessari  per  la  replicazione  del  DNA  (sono  spesso  chemioterapici  per  

il  cancro  allo  stomaco,  al  colon,  ecc.).    

La   processività   della   polimerasi   è   la   capacità   di   sintetizzare   un   filamento   oligonucleotidico  

senza  staccarsi  dallo  stampo:  esistono  varie  polimerasi  nelle  cellule  che  si  distinguono  per  la  

loro   processività.   Normalmente   la   polimerasi   responsabile   della