Appunti Fermentazioni industriali

Fermentazioni industriali: alimenti e ingredienti di origine microbica

In passato, in tutte le parti del mondo, le popolazioni hanno sfruttato l’attività metabolica dei microrganismi per la produzione di alimenti. Ad esempio, il primo alimento ottenuto con l’impiego dei microrganismi fu la birra (con Saccharomyces cerevisiae), che è appunto una bevanda fermentata. Poi si iniziò a produrre il vino che, attraverso la movimentazione delle merci e delle conoscenze, arrivò fino all’Europa meridionale (in cui sono nati i primi porti). Segue la produzione di pane e formaggi. Tutte queste sono produzioni alimentari che prevedono fermentazioni anaerobie.

Fermentazione e sviluppo della microbiologia

Fermentazione: con il termine fermentazione si intendono tutti quei metabolismi che avvengono in anaerobiosi. In passato le fermentazioni avvenivano ovviamente su piccola scala, in condizioni poco controllate (erano produzioni familiari). Fondamentali furono l’avvento del microscopio e della microbiologia che portarono alla capacità di isolare i microrganismi responsabili di tali produzioni in colture pure. Questo, insieme alla fisiologia microbica, spinse allo sviluppo di processi biotecnologici controllati.

I primi processi nascono infatti in coltura solida (SSF-Solid State Fermentation): reattore "sdraiato" (letto di matrice sopra alla quale crescono i microrganismi). Il problema di tale tecnologia è la difficoltà di controllo e standardizzazione (metabolismo microbico che genera calore e quindi la coltura può arrivare fino a condizioni difficili per il microrganismo stesso; difficile controllo della temperatura con coltura solida). Inoltre, con una matrice solida, risulta complicato il recupero del prodotto.

Si passò quindi al terreno colturale liquido (SmF-Submerged Fermentation), con il quale aumentano e cambiano i volumi. In tale periodo si hanno evoluzioni dei bioreattori e dell’ingegneria quindi si hanno processi che possono avvenire sia in aerobiosi che in anaerobiosi (a seguito della messa a punto della linea dell’aria).

Categorie di microrganismi e importanza dell'ossigeno

I microrganismi possono essere divisi in tre grandi categorie:

• Aerobi: necessitano di ossigeno;
• Anaerobi: necessitano di assenza di ossigeno;
• Anaerobi facoltativi, anaerobi ossigeno-tolleranti, ecc.: crescono sia in assenza che in presenza di ossigeno (che generalmente però deve essere poco).

L’ossigeno viene recuperato dall’aria atmosferica (non molto ricca di ossigeno, circa 20%). Nei bioreattori bisogna fare in modo che tale ossigeno arrivi all’interno della coltura (perché il microrganismo in coltura liquida necessiterà di ossigeno disciolto): sensore dell’ossigeno disciolto che misura la quantità di ossigeno presente nel terreno liquido (saturazione). Il vantaggio è che il recupero del prodotto in coltura liquida è più efficiente (da qui il contributo importante delle colture sommerse). Questo permette inoltre, di avere rese di prodotto economicamente attrattive (principio base delle fermentazioni industriali).

Processi biotecnologici e competitività

Riproducibilità: un processo è riproducibile quando lo si allestisce più volte nelle stesse condizioni e si ritrova sempre una quantità analoga del prodotto che si vuole vendere. Esempio nicotina: se cellule della pianta del tabacco in grado di produrre nicotina, allestisco il processo 10 volte al mese e in fermentatore ottengo sempre la concentrazione idonea di nicotina. La garanzia di riproducibilità è importante, soprattutto per quanto riguarda la competitività degli organismi vegetali.

Qualità: i processi biotecnologici se “ben fatti” permettono di ottenere un prodotto idoneo al consumo.

Stimoli all’espansione delle biotecnologie

• Grande disponibilità dei residui a basso costo del settore dell’industria agroalimentare: melassi, residui legno cellulosici come i liscivi solfitici, residui da amido di mais, N-alcani, ecc. Questi residui sono disponibili, economici, riproducibili e permettono di ottenere un prodotto di qualità;
• Scarsità di componenti per l’industria alimentare: come l’acido citrico. L’Italia aveva il monopolio dell’estrazione dell’acido citrico dagli agrumi (prezzo imposto dall’Italia). È poi aumentata la richiesta di acido citrico quindi intorno agli anni ‘60 è stato messo a punto in Belgio un processo di produzione di questo acido a partire da Aspergillus niger. Ormai il 99% di acido citrico commercializzato e prodotto nel mondo è da Aspergillus niger, la cui coltivazione avviene in fermentatore (prima era in coltura solida);
• Inserimento sul mercato di nuovi prodotti: come ad esempio gli antibiotici, enzimi, nutraceutici (integratori alimentari) e proteine eterologhe (prodotte dall’inserimento dell’informazione genetica nel microrganismo). Un esempio è la vitamina B12, che viene prodotta esclusivamente a partire da microrganismi. Queste innovazioni hanno spinto il settore delle biotecnologie.

Vantaggi e sviluppi delle biotecnologie

Allestire un processo, che prevede l’utilizzo di un microrganismo in condizioni controllate, consente di avere una produzione continua indipendentemente dagli eventi esterni (ci si svincola da problemi dovuti alla stagionalità, ad eventi climatici avversi e altri fattori fisiologici). Altri fattori positivi sono la collaborazione e l’interdisciplinarietà necessaria per l’ottimizzazione di un processo.

Microbiologo: individua il microrganismo di interesse attraverso protocolli di screening e mette a punto le condizioni operative (terreno colturale, pH, temperatura e ossigeno). Si inizi con l’incremento dei volumi di produzione per capire se, all’aumentare della scala, il processo mantiene le sue caratteristiche oppure no (scale-up\up-scaling).

Tipologie di colture su scala industriale

• Coltura batch: sistema chiuso (non si hanno grandi prelievi o grandi aggiunte). È la più utilizzata perché versatile, riproducibile e minime contaminazioni;
• Coltura feed-batch: si parte con terreno colturale base e poi nel tempo inoculo diverse quantità di terreno colturale (volume finale maggiore del volume iniziale);
• Coltura continua: sistema dinamico in cui si hanno flussi d’ingresso e d’uscita (volume che rimane costante).

Miglioramento genetico e OGM

Si può tentare un approccio di miglioramento genetico (scoprire se si può produrre di più di quello che si è ottenuto in laboratorio) con il miglioramento genetico della produttività. Nel settore alimentare però l’utilizzo di microrganismi geneticamente modificati non è gradito (approvati molto difficilmente: attività normative restie ma anche il consumatore stesso). Inoltre, non è sempre garantito il successo commerciale degli OGM.

Biotecnologie e sostenibilità

È importante un’azione di alfabetizzazione scientifica e creare un confronto aperto e democratico rivolto alla popolazione da parte di chi conosce la scienza. È anche importante sviluppare buone pratiche di impiego delle biotecnologie, mirate al progresso scientifico e al benessere dell’umanità. Obiettivi:

• Tutelare i diritti individuali;
• Evitare qualsiasi discriminazione sociale;
• Rispettare l’ambiente e la biodiversità;
• Valorizzare le ricadute economiche sia in termini di prospettive di sviluppo imprenditoriale, sia in termini di nuove opportunità lavorative.

Le biotecnologie sono una parte importante di quella che è l’economia circolare: insieme di buone pratiche che mirano a ridurre il più possibile gli scarti di qualsiasi settore e ottimizzano invece la trasformazione, il riutilizzo, ecc.

Se guardiamo un ciclo produttivo e lo pensiamo in termini di economica circolare, le biotecnologie hanno un forte impatto. Si possono produrre materie prime che vengono poi impiegate per creare polimeri e altro: queste vanno al consumatore che le utilizza, portando ad uno scarto. Lo scarto verrà incenerito (recupero energia), biodegradato o recuperato e riutilizzato.

Esempio PLA: si parte da residui del settore alimentare per creare acido lattico. Poi polimerizzazione e formazione acido poli-lattico (materiale biodegradabile per sacchetti e contenitori). Questo materiale alla fine del ciclo di vita può essere riutilizzato. L’economia circolare punta a minimizzare le perdite.

Biotecnologie applicate ai processi fermentativi

Le biotecnologie sfruttano i microrganismi per produrre qualcosa che ci interessa. Aspetti da considerare:

• Come il microrganismo vuole riforniti i nutriliti (componenti necessari per lo sviluppo)?
• Quanto tempo è necessario per far sì che il processo sia produttivo?
• Quale impianto serve?
• Come si risparmia l’energia?
• Quanto prodotto ottengo?

L’aspetto più importante a cui mira l’azienda è il fatturato (le aziende devono essere solide) quindi, il prodotto che si ottiene deve avere sostenibilità dal punto di vista della gestione dei costi e dei ricavi.

Processi biotecnologici e chimici

Entrambi mettono a disposizione tante molecole quindi, questi sono sempre in competizione. Vi sono settori in cui i processi di sintesi chimica sono imbattibili, al contrario alcuni in cui i processi di sintesi biotecnologica sono più importanti. Per composti a basso PM è avvantaggiata la sintesi chimica ma, per le molecole complesse, prevale la sintesi biotecnologica (questo perché la sequenza delle proteine non può essere alterata altrimenti si perde la loro attività, oppure per enzimi, antibiotici, vaccini, polisaccaridi, ecc.).

Poi vi è una sorta di “mondo” di mezzo costituito da molecole non troppo grandi ma più complicate delle molecole di base. Questa è una zona di competizione (a volte conviene un processo e a volte un altro). La necessità di una tecnologia piuttosto che di un’altra, dipende dal costo e dalla tipologia della materia prima.

Ottenimento del bioprodotto

Al fine di ottenere un bioprodotto bisogna considerare:

• Condizioni di produzione (che potrebbero non coincidere con quelle ottimali di crescita del microrganismo). Ad esempio, l’Aspergillus cresce in determinate condizioni ma io voglio fargli produrre l’enzima amilasi e quindi lo pongo in condizioni idonee per tale obiettivo (sostituisco il glucosio con una fonte di amido, come la crusca il microrganismo non ha il glucosio quindi per recuperarlo dal substrato produce l’amilasi per idrolizzarlo e ricavare glucosio). Al fine di mantenere questa attività metabolica bisogna trovare le condizioni più rigorose di composizione del terreno colturale, come modificarle nel tempo, come settare la T di processo e il pH. Per i batteri lattici, ad esempio, bisogna aggiungere correttore di pH, altrimenti questi producono troppo acido lattico abbassando il pH del terreno e di conseguenza, inibendo i batteri lattici stessi;
• Il concetto di sterilità, che è assoluto: esempio di un bioreattore in cui viene inoculato un microrganismo per produrre amilasi. L’ambiente all’interno deve essere sterile, ovvero non ci deve essere altro microrganismo oltre a quello inoculato. Contrariamente, si avrebbe un microrganismo competitore che sequestrerebbe nutrienti a quello inoculato, con conseguente elevata perdita dei costi;
• L’idrodinamica: il bioreattore contiene coltura liquida di microrganismo che fa attività metabolica. Bisogna fare in modo che nel fermentatore ci sia omogeneità (altrimenti sofferenza del microrganismo). Infatti, c’è un sistema di agitazione, fondamentale soprattutto per i microrganismi aerobi (in ogni punto della coltura deve esserci ossigeno per il continuo dell’attività metabolica);
• Purificazione del prodotto: il bioreattore infine viene scaricato e il prodotto potrebbe costituire una resa molto bassa quindi, di conseguenza, bisogna separarla dal resto. Questa fase dipende da quello che sarà l’utilizzo finale del prodotto stesso. Ad esempio, produco lievito con elevato contenuto proteico (candida) che viene dato a chi si occupa di formulare i mangimi per animali da allevamento (aumentando così il valore nutrizionale dei mangimi). In questo caso ho un fermentatore dove far crescere elevate biomasse di tale lievito, da separare poi dal liquido e se non è totalmente purificata non è importante. Nel caso di un farmaco invece, come l’insulina, questa dovrà avere un grado di purificazione elevatissimo (deve entrare nella soluzione di una formulazione sterile e con grado di purificazione massimo). Il prodotto isolato deve essere poi il più stabile possibile;
• Recupero dei costi: si lavora in un’impresa e quindi bisogna mettere a punto un processo che abbia un senso economico (se produco qualcosa con processo costosissimo, non ho fatturato);
• Rischio: i processi, inoltre, devono avere il minor rischio, sia dal punto di vista del personale, che dal punto di vista ambientale (più sostenibili sono meglio è). Nel caso di sostenibilità ambientale, i processi di sintesi biotecnologica sono molto più avvantaggiati.

Metaboliti primari e secondari: rapporti con lo sviluppo microbico

Generalmente, la microbiologia industriale si occupa di produrre biomasse, metaboliti primari o metaboliti secondari.

• Biomasse: ho un substrato in cui inoculo il microrganismo, sterilità e condizioni di processo, esso cresce e fine;
• Metaboliti primari: per definizione è una molecola che si forma nel corso della crescita delle cellule e si forma sempre. Esempio, acido lattico dai batteri lattici. Coltura di batteri lattici che hanno come prodotto finale l’acido lattico (quindi se in condizioni di svilupparsi producono tale acido, direttamente correlato);
• Metaboliti secondari: sono molecole che il microrganismo produce quando smette generalmente lo sviluppo cellulare (non sono associati allo sviluppo microbico). In questo caso possono avvenire due fenomeni:
  • Le cellule crescono, arrivano alla fase stazionaria, cambiano le condizioni (di terreno e generali), il microrganismo attiva nuove vie metaboliche e inizia a mescolare composti (generalmente a base carboniosa) e li struttura in molecole diverse. Ad esempio, alcuni antibiotici;
  • Le cellule fanno un metabolita primario (durante il corso dello sviluppo microbico) che, quando la cellula arriva in fase stazionaria, verrà utilizzato come base di partenza per la costruzione di un’altra molecola. Esempio di alcuni funghi, come Aspergillus terreus, che è in grado di produrre una serie di composti con attività farmacologica (statine: abbassano il colesterolo nel sangue).

La varietà dei metabolismi è una diretta conseguenza della complessità di un microrganismo. I procarioti non hanno una grande varietà di vie metaboliche (es. batteri lattici hanno solo via anaerobia per produzione di acido lattico, al contrario le muffe e i funghi hanno metabolismi diversificati che comprendono molte vie metaboliche per la costruzione delle molecole).

Tra le più semplici vie metaboliche vi sono quelle del metabolismo anaerobio (comprese le fermentazioni). Sono interessanti dal punto di vista delle biotecnologie perché riescono ad accumulare in maniera importante acidi organici (lattico, butirrico, propionico, etanolo, anidride carbonica, ecc.).

I microrganismi aerobi invece, hanno glicolisi, via dei pentosi fosfati, ecc. e una successiva serie di metabolismi (tra i quali il ciclo di Krebs), che permettono di ottenere prodotti interessanti. Questi possono essere sintetizzati in eccesso rispetto a quelle che sono le esigenze fisiologiche (situazione che si desidera nei processi biotecnologici).

Metabolismo microbico

Il metabolismo microbico è un insieme di due processi:

• Fase catabolica: fase in cui le cellule ricavano energia dalla scomposizione\ossidazione di sostanze con cui vengono a contatto. Con un terreno colturale più o meno complesso, il microrganismo degrada i componenti e fa quello per cui è cresciuto (sviluppare progenie; il fine ultimo di un microrganismo è quello di riprodurre sé stesso). Dal catabolismo si ottengono intermedi (es. tutti quelli del ciclo di Krebs), ATP e NADH. NADH deve tornare a NAD+ altrimenti il ciclo si blocca;
• Fase anabolica.

Nel metabolismo anaerobio, con il catabolismo otteniamo 2 ATP (bassi livelli di energia). Il microrganismo, attaccando il glucosio, produce poca energia. Quindi si ha poca energia da utilizzare nella fase anabolica.

Nel metabolismo aerobio invece, si ha glicolisi, ciclo di Krebs e catena di trasporto. Molte molecole vengono riutilizzate. Sono più performanti gli aerobi ad utilizzare la fonte di carbonio: da un glucosio si arriva a 36 ATP. La fase catabolica non è quindi veloce come quella anaerobia. Il guadagno totale tra aerobio e anaerobio, è spostato verso quello aerobio. Il ciclo di Krebs è una base di partenza "pazzesca" per la sintesi di nuovo materiale e di nuove molecole (importante dal punto di vista tecnologico). Ad esempio, il citrato oltre ad essere venduto cos’ com’è, serve per sintetizzare acidi grassi e colesterolo.

Differenza tra i prodotti del metabolismo aerobio e anaerobio

• Anaerobio: lavorano tanto (importante consumo di substrato) e guadagnano poco. Il prodotto finale viene accumulato in elevate quantità spontaneamente. Le cellule sono in misura limitata (non crescono tanto);
• Aerobio: ha un anabolismo molto importante. I prodotti finali sono cellule, anidride carbonica ed acqua. Si ottiene molta energia per ogni unità di substrato.