Appunti delle lezioni di Biotecnologie - Fermentazioni industriali

Biotecnologie - fermentazioni industriali

I primi processi microbiologici nascono molto prima della biotecnologia moderna, molte popolazioni hanno sfruttato inconsapevolmente l’attività microbica.

Nelle fasi storiche si trattava di processi svolti in anaerobiosi in condizioni poco controllate.

Con l’invenzione del microscopio si ha il salto e nel settore alimentare le due cose che hanno cambiato la biotecnologia sono state:

• Avere colture pure a disposizione con cui ripartire e ottenere processi controllati.
• Conoscenza della fisiologia microbica.

I processi controllati avvengono con impiego di colture solide (SSF – solid state fermentation) sulle quali si possono far crescere micro.

Nascono anche fermentatori particolari per colture solide, qui si ha il problema del controllo del processo e del recupero della materia solida.

Nel tempo le colture solide vengono sostituite da colture liquide (SmF - submerged fermentation), si preparano terreni colturali liquidi allestiti impiegando bioreattori.

I processi possono essere allestiti anche in aerobiosi; il controllo è meticoloso e il recupero comincia a diventare efficiente.

Le rese di recupero sintetizzate dai microrganismi iniziano a diventare attrattive.

Quando si allestisce un processo microbiologico è importante:

• Garantire riproducibilità: nelle stesse condizioni bisogna ottenere lo stesso risultato; se ho un processo che non rende gli stessi risultati è un problema.
• Qualità adeguata a soddisfare i requisiti normativi di sicurezza per il consumo umano; mettere a punto un prodotto che può essere venduto per l’alimentazione.

Gli stimoli più significativi all’espansione dello sfruttamento dei micro sono stati:

• Grande disponibilità di ingredienti a basso costo che possono essere usati come substrati per lo sviluppo microbico.
• Il settore agroalimentare è un settore che produce scarti (melassi, liscivi solfitici, residui da amido di mais, N-alcani).
• Scarsità di processi per l’ottenimento di prodotti ad elevato valore aggiunto (acido citrico inizialmente estratto da agrumi, questo ha spinto la ricerca verso processi di produzione di questo acido che ora si produce con Aspergillus niger).
• Inserimento nel mercato di nuovi prodotti (produzione di antibiotici, enzimi, nutraceutici, proteine eterologhe).

Perché allestire un processo microbiologico?

Il prodotto ottenuto per via microbiologica, se lo standardizzo (condizioni controllate, scelta dell’inoculo e processo), garantisce una produzione continua e indipendente da eventi avversi come stagionalità, eventi climatici etc.

Un’altra spinta è stata l’interdisciplinarietà necessaria all’ottimizzazione di processo (saper lavorare in team).

Inoltre, si è capito che si può lavorare anche sulla tipologia di coltura, il modo di far crescere i microrganismi.

A volte, nell’evoluzione di un processo biotecnologico, potrebbe essere utile anche un approccio di miglioramento genetico della produttività, sul ceppo allo studio. L’obiettivo è anche quello di rendere più attraente dal punto di vista economico il processo.

Le autorità di controllo raramente approvano l’impiego di organismi geneticamente modificati nel settore alimentare.

I consumatori spesso hanno preclusioni verso i prodotti ottenuti di OGM; quindi, l’innovazione biotecnologica non sempre garantisce il successo commerciale.

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Quello che dice la comunità europea sulle biotecnologie è che è necessaria una azione di alfabetizzazione scientifica sulle potenzialità e i rischi delle biotecnologie, in modo da creare un confronto aperto e democratico.

Sviluppare normative che indirizzino verso una buona pratica di impiego delle biotecnologie, mirata al processo scientifico e al benessere dell’umanità in grado di:

• Tutelare i diritti individuali.
• Evitare discriminazione sociale.
• Rispettare ambiente e biodiversità.
• Valorizzando ricadute economiche in termini di prospettive e sviluppo imprenditoriale e di nuove opportunità.
• Coniugare i valori di mercato con quelli di una etica della salute.

Le biotecnologie spesso vengono coniugate nell’ambito dell’economia circolare, ovvero un processo che tende a utilizzare i residui o gli scarti costruendo cicli di produzione alternativi sempre nello stesso settore.

Bisogna rispondere ad una serie di domande: in che quantità devo avere i nutrienti e l’inoculo? Quanto tempo mi servirà? Di che impianto ho bisogno? Come posso risparmiare energia? Quanto prodotto otterrò?

Processi biotecnologici e chimici

La produzione biotecnologica è sempre in competizione con la produzione per sintesi chimica.

Quando le molecole sono piccole (etilene, propilene) è più facile la sintesi chimica con petrolio, carbone o gas naturale; in opposto le molecole complesse (proteine, enzimi, antibiotici, vaccini) necessitano di processi microbiologici con microrganismi.

La zona centrale è di competizione (singoli amminoacidi, peptidi, acidi organici, solventi) effettuata con carburanti, prodotti energetici.

Dal punto di vista biotecnologico bisogna capire il microrganismo, quali vie metaboliche fargli seguire.

Ci deve essere controllo rigoroso di composizione del terreno colturale, pH e temperatura.

Un altro requisito è il mantenimento della sterilità, non posso permettere che qualcun altro entri nella mia coltura e consumi il substrato.

Bisogna controllare l’idrodinamica del bioreattore; la coltura deve essere omogenea.

Ci devono essere ovunque aria e nutrienti.

Una volta finito il mio processo devo ottenere il prodotto che spesso è diluito in un brodo di coltura; quindi, devo purificare il mio prodotto in una forma stabile.

Devo effettuare un recupero dei costi, devo mantenere il minimo rischio per il personale e per l’impianto.

Lezione 2

Un microrganismo viene inoculato in un terreno di coltura e attraversa una serie di fasi di sviluppo, può produrre biomassa o componenti che poi vendiamo.

Può succedere che le cellule utilizzino il substrato (insieme di nutrienti con carbonio), il micro cresce, la biomassa aumenta di numero e peso e contemporaneamente il micro produce composti catalogati come metaboliti primari (l’acido lattico è un metabolita dei batteri lattici).

Può succedere anche che un micro mentre cresce produce il metabolita primario e ad un certo punto si attivano linee metaboliche nuove e si accumuli un altro prodotto che sarebbe il metabolita secondario non legato allo sviluppo microbico (antibiotici).

In ultimo caso abbiamo il micro che consuma substrato per produrre cellule e metaboliti primari, ma ad un certo punto questo metabolita viene modificato strutturalmente per diventare un altro prodotto (succede per le statine che vengono prodotte da muffe come metaboliti secondari, non subito ma più avanti nello sviluppo quando si accumulano molecole di acetato).

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La produzione di nuove molecole nei processi microbiologici è molto importante. I micro lavorano a temperature non estreme e fattibili.

Distinguiamo i micro anaerobi da quelli aerobi.

Anaerobi: batteri lattici ad esempio. Sono stati i primi ad essere utilizzati perché sono i più facili da coltivare in grande scala. Crescono senza richiedere ossigeno, non bisogna attivare una linea di aria. Questi possono produrre molto bene i metaboliti primari perché è il prodotto finale del loro metabolismo e loro lo accumulano spontaneamente (i batteri lattici prendono il glucosio, seguono glicolisi, vanno ad acido piruvico e poi acido lattico), ancora producono acido butirrico, propionico.

Aerobi: dal punto di vista metabolico ha la glicolisi, il ciclo di Krebs e la catena di trasporto degli elettroni. Dalla glicolisi si ha l’acido piruvico, nel ciclo si ha 1 ciclo e non si accumula niente di particolare che non siano intermedi energetici, a parte l’ATP che serve per fare nuove cellule. Quello che si può fare con questi micro è lavorare sull’ottenimento degli intermedi metabolici. In particolare ci sono alcuni componenti interessanti che possono essere gli acidi organici, alcuni aminoacidi, nucleotidi e loro derivati, lipidi, vitamine. Ci sono anche una serie di componenti che non possono essere considerati intermedi metabolici e prendono il nome di metaboliti secondari come alcaloidi, polisaccaridi, antibiotici.

Un micro ha il fine ultimo di duplicare se stesso, per fare progenie ha bisogno di energia.

Il metabolismo è costituito da catabolismo (serve per la degradazione del substrato per ottenere energia) e da anabolismo (fase di sintesi).

Il metabolismo microbico indica l’insieme di catabolismo e anabolismo.

Tutte queste reazioni sono finemente regolate perché il micro non consuma e non produce più delle necessità fisiologiche. È importante, per un microbiologo, riuscire a capire quali sono le vie che il micro usa per sfruttarle al meglio; un micro non produrrà mai più di quello che a lui è strettamente necessario.

Metabolismo anaerobico

I batteri lattici hanno un metabolismo molto semplice: substrato che può essere glucosio, con la glicolisi ottengono il piruvato.

Durante la glicolisi viene prodotto NADH e nel corso della glicolisi, abbiamo sempre la generazione da NAD+ a NADH. Ad un certo punto avremo l’accumulo del potere riducente di NADH e si sarà consumato tutto il NAD+, quando non ho più NAD+ libero, la glicolisi si interrompe perché non ho più potere riducente. Per rigenerare questo NAD+ intervengono i batteri lattici che scaricano i due idrogeni sulla molecola di acido piruvico e ottengono acido lattico. Il NADH ritorna NAD+ e la glicolisi procede. Quindi l’accumulo di acido lattico è dovuto al fatto che i micro devono rigenerare il NAD.

Da un micro anaerobio si ottengono pochi ATP, ovvero solo 2 che si producono nella glicolisi.

La conseguenza di questo metabolismo è che il batterio lattico deve consumare tanto glucosio per ottenere 2 ATP ogni volta, il risultato è comunque poca ATP e quindi non si ha tanta energia per fare la fase anabolica, quindi i micro non crescono tanto.

Però questi accumulano tanto il prodotto finale.

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Metabolismo aerobico

La prima parte è uguale. L’acido piruvico poi, entra nel ciclo di Krebs, questo ciclo da acetil ridotto, NAD, FAD, questi devono andare nella catena di trasporto elettroni. Gli ATP che si generano sono molti, ovvero 36 per ogni glucosio consumato.

Un micro aerobio riesce quindi a produrre molte più cellule a parità di substrato perché ha a disposizione più energia.

Nei micro aerobi il potere riducente si rigenera buttando idrogeno sull’ossigeno che funge da accettore finale.

Il ciclo di Krebs è una parte del metabolismo, specificatamente del catabolismo, molto utile per i microrganismi perché vengono prodotti e consumati molti composti che sono tutti mattoncini che possono essere usati per la sintesi di molecole nuove. L’acido citrico è uno dei primi composti che si formano nel ciclo di Krebs.

I micro anaerobi accumulano spontaneamente tanti intermedi e poche cellule. Un micro aerobio ottiene cellule, anidride carbonica e acqua che sono i prodotti finali del metabolismo, tende a non accumulare niente perché utilizza.

Strategie: per accumulare o ottenere i prodotti, dobbiamo capire quale è la via metabolica che il micro utilizza; poi posso provare a utilizzare enzimi per alterare il metabolismo microbico e regolare i processi fermentativi.

Accumulare intermedi metabolici non vuol dire sempre modificare il DNA, spesso si può ottenere sbilanciando il terreno colturale.

È chiaro che non posso far produrre un composto a un micro che non è in grado di farlo, solo in questo caso modifico il DNA prendendone uno che codifica per determinati geni. Negli altri casi si sfruttano vie metaboliche che il micro ha già e si cerca di fare in modo che il micro non attui le regolazioni di cui è capace.

Per ogni via metabolica del micro, si ha una regolazione enzimatica. Gli enzimi possono essere sintetizzati (tanto o poco) e posso avere un’attività di modificazione di una via metabolica attraverso nuovi enzimi; oppure posso far lavorare meglio l’enzima già presente.

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Sintesi degli enzimi

Esistono enzimi costitutivi: sono sempre formati, quindi posso modificare solo la loro performance, posso farli lavorare meglio ma non produrne di più.

Enzimi inducibili: non vengono prodotti sempre, vengono risparmiati e la loro sintesi parte solo quando la cellula vede che c’è bisogno di quegli enzimi; quindi, quando è presente un induttore (composto che attiva la loro sintesi). Possiamo indurne la sintesi in una fase che non è tipica per il micro, oppure regolarne l’attività.

La concentrazione di metaboliti è funzione di sistemi di controllo dell’attività enzimatica: inibizione.

Per ottenere accumuli metabolici

Prendendo in esempio la via metabolica lineare: il prodotto che otteniamo dalla catena può effettuare:

• Inibizione esplicata dal prodotto finale sull’attività del primo enzima della via metabolica (quando si accumula troppo prodotto, automaticamente si arresta).

E1 E2 E3

C P A B

• Repressione esplicata dal prodotto finale sulla sintesi di uno o più enzimi della via metabolica.

E2 E3 E1

A B C P

Per ottenere l’accumulo di P e interrompere l’inibizione bisogna toglierlo dalla cellula, non far sentire al micro l’accumulo di P.

Per una via metabolica ramificata è più complicato. I metaboliti prodotti in una via ramificata non sono generalmente necessari in livelli analoghi e quindi sono sintetizzati in diversa concentrazione a seconda di quello che serve al micro.

P1 D E1 A B C E P2

Sia P1 che P2 agiscono su E1 con un’azione di inibizione o repressione, ogni P però agisce sull’enzima della propria catena e questo consente l’accumulo selettivo del prodotto.

Per evitare i fenomeni di inibizione spesso si allontana il prodotto, si fa fuoriuscire dalla cellula il prodotto.

Modificazione della permeabilità cellulare: favorisce la fuoriuscita di un metabolita sintetizzato e accumulato all’interno della cellula.

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Esempio: acido glutammico.

Blocco metabolico: Il microrganismo diventa incapace di sintetizzare il prodotto finale i cui livelli controllano l’attività di un enzima con ruolo chiave sulla via metabolica.

Accumulo metabolita non associato allo sviluppo

Processo suddiviso in due fasi:

• Trofofase: fase di sviluppo.
• Idiofase: fase di accumulo del composto.

Nei metaboliti primari queste due coincidono.

Per i metabolismi secondari sono separate e l’idiofase può avvenire in caratteristiche anche diverse.

Perché ci sia accumulo devono esserci due condizioni:

• Impiego di un idoneo terreno colturale.
• Il microrganismo deve avere caratteristiche genetiche adatte.

Accumulare prodotti del metabolismo secondario è difficile. Gli enzimi responsabili della biosintesi dei metaboliti secondari sono repressi durante la trofofase.

• Sintesi nella idiofase, di prodotti finali non essenziali per lo sviluppo del microrganismo, a partire da metaboliti primari.
• Fase biosintetica attraverso vie metaboliche non utilizzate dalla cellula nella fase di sviluppo.
• Gli enzimi responsabili della biosintesi dei metaboliti secondari sono repressi durante la trofofase.
• L’isolamento di ceppi meno sensibili all’inibizione da prodotto consente di ottenere ceppi in grado di fornire più alte rese di prodotto.

È importante capire la tipologia del metabolismo che il micro ha.

Per capire come il micro fa a sintetizzare una molecola, si usano gli studi di biogenesi che indaga su quali metodi il micro usa per costruire le molecole più grandi.

Quello che si cerca di fare è di prendere la molecola più grande e cercare di scomporla in componenti più semplici è utilizzare isotopi radioattivi che possono emettere radiazioni oppure avere differente peso atomico; viene valutata l’incorporazione di isotopi nei metaboliti isolati.

EFB: European Federation of Biotechnology definisce la biotecnologia come uso integrato di biochimica, microbiologia e ingegneria allo scopo di perseguire l’applicazione tecnologica-industriale della capacità dei microrganismi, delle colture di cellule di tessuti o di loro parti.

Dobbiamo arrivare a livello industriale operando in modo che le tre materie si uniscano nelle competenze per creare un processo robusto (che dia le stesse rese).

Questi processi servono a produrre biomasse; molecole, che vengono accumulate all’interno della cellula o che il micro rilascia (metaboliti intra o extra cellulare); prodotti ottenuti per biotrasformazione, il micro trasforma selettivamente una molecola in una diversa, sfruttiamo una capacità del micro che trasforma un substrato in un prodotto.

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Schema di un processo di fermentazione industriale

Schema di un processo di fermentazione industriale: un processo che usa micro, ha una serie di step che devono essere condotti: preparazione terreno a partire dai singoli ingredienti; sterilizzazione terreno; inoculo microorganismo; crescita; rifornimento aria se necessario; completamento processo in un tempo definito; spegnimento e scarico fermentatore coltura liquida va in una fase di purificazione del prodotto, si separa la biomassa da tutta la parte liquida.

Tutte le fasi che coinvolgono la preparazione del processo, compreso il processo, prendono il nome di Upstream; le fasi di ottenimento del prodotto finito prendono il nome di Downstream.

Quando abbiamo un processo fermentativo dobbiamo tener presente che:

• Nell’upstream l’importante è il mantenimento e il controllo del microrganismo. Ci sono laboratori che controllano che la coltura sia pura etc, e che lo sviluppo