Biotecnologia dei microorganismi - Appunti

Introduzione alle biotecnologie dei microorganismi

La microbiologia è una scienza di base che va a studiare i processi vitali dei microrganismi. La microbiologia può essere applicata a livello medico, agricolo e industriale. I microrganismi possono infatti essere dannosi per l’uomo, per le piante e per l’ambiente e prendono il nome di patogeni. I microrganismi possono anche essere utili, per la vita terrestre, grazie ai cicli biogeochimici di cui sono in parte i mediatori; per l’uomo colonizzando alcuni habitat all’interno dell’uomo, per l’industria, per gli alimenti e per l’ambiente. I processi industriali in cui vengono utilizzati microrganismi prendono il nome di biotecnologie: studio e programmazione dei meccanismi microbiologici atti alla produzione di una specifica molecola/sostanza.

Il campo di applicazione della microbiologia, e quindi delle biotecnologie, comprende l’ambiente, il terreno (cicli biogeochimici); i rifiuti (compostaggio); gli alimenti (conservazione dei prodotti) e le fermentazioni (produzione di specifici alimenti e bevande). Inoltre, l’applicazione può essere estesa anche alla farmaceutica, alla diagnostica e all’agricoltura (produzione di biodiesel ed etanolo dal mais).

Storia delle biotecnologie

I primi processi biotecnologici si riscontrano già al tempo degli Assiri come la produzione della birra e del vino. La produzione di bevande alcoliche è stato infatti uno dei primi step. Da lì l’utilizzo delle biotecnologie è cresciuto sempre di più col passare del tempo:

• 1680 - Prima identificazione delle cellule di lievito.
• 1857 - Pasteur attua la fermentazione.
• 1914-1916 - Produzione di lieviti per la panificazione.
• 1941 - Produzione della penicillina.
• 1953 - Scoperta del DNA.
• 1973 - Prima espressione di un gene eterologo.
• 1982 - Sviluppo dei primi microrganismi da tecnologia del DNA ricombinante.

Inoltre, oltre ad un aumento dell’impiego delle biotecnologie, dal 1929 al 1970 per la produzione della penicillina c’è stata un aumento notevole delle modalità di produzione in modo da permettere migliorie importanti! Le modifiche utilizzate sono dovute alla ricerca in campo che ha permesso l’utilizzo di altri metodi per la sua produzione con un rendimento migliore (da 20 unità/ml a 10'000 unità/ml).

Microorganismi coinvolti

I principali microorganismi utilizzati per la produzione di bevande e alimenti sono:

• Vino -> S. cerevisiae; Zygosaccharomyces spp.; Hanseniaspora spp.; batteri lattici.
• Birra -> S. cerevisiae.
• Pane -> S. cerevisiae.
• Aceto -> Acetobacter; gluconobacter.
• Prodotti caseari -> Lactobacillus, Streptococcus thermophylus; Penicillium; Propionibacterium.

I principali microorganismi utilizzati per la biotrasformazione (produzione di prodotti di vario genere) sono:

• Destrano -> Leuconostoc
• Butano-acetone -> Clostridium acetobutyricum
• Antibiotici -> batteri, funghi, attinomiceti
• Acido citrico -> Aspergillus niger, Yarrowia lipolytica
• Enzimi -> funghi, batteri, lieviti
• Acido lattico -> Lactobacillus delbrueckii
• Etanolo -> Saccharomyces cerevisiae, Zymomonas mobilis
• Vitamine -> batteri, funghi, lieviti

Modalità di produzione

I microorganismi hanno la capacità di produrre tutte queste sostanze di interesse biotecnologico grazie al loro metabolismo. Nello specifico è possibile suddividere 2 processi fondamentali:

• Aerobio - Processo di respirazione, nel quale vengono prodotti enzimi, acido citrico, acido glutammico.
• Anaerobio - Processo di fermentazione, nel quale vengono prodotti etanolo, acido lattico, acetone, butano, glicerina.

A questo punto è importante anche suddividere il prodotto/sostanza da ottenere in base alla localizzazione o momento di produzione da parte del microrganismo:

• Biomassa microbica, quando tutte le sostanze prodotte si accumulano all’interno dei batteri. Questo è il caso di proteine, lipidi ecc.
• Metaboliti primari, se la produzione avviene secondo la via principale del MO.
• Metaboliti secondari, se la produzione avviene in alcune condizioni o con una quantità minore del MO.
• Prodotti complessi, se si deve produrre molecole ad alto peso molecolare o con modificazioni da parte del MO.
• Prodotti per biotrasformazione, se la produzione avviene per detossificazione da parte del MO di una specifica sostanza.

Diversificazione e classificazione microbica

Per classificare i microorganismi necessari alle biotecnologie e valutare la differenza tra l’utilizzo di un microorganismo e l’altro si prendono in considerazione principalmente tre fattori: la tassonomia strutturale; la diversità (eucarioti e procarioti); la diversità metabolica.

Diversità strutturale

Come primo punto bisogna fissare le differenze tra una cellula procariotica e una cellula eucariotica:

• Membrana plasmatica -> Negli eucarioti è composta anche da steroli che permette la fluidità della stessa; nei procarioti vi è assenza di steroli e utilizzo di opanoidi (con stessa funzione). Inoltre in quest’ultimo è solito ritrovare delle invaginazioni chiamate mesosomi.
• Nucleo -> Nei procarioti è disperso all’interno del citoplasma, di forma circolare e senza proteine annesse. Negli eucarioti è delineato da membrana (involucro nucleare), è di forma lineare diviso in più cromosomi e complessato con proteine (istoni). Il DNA procariotico inoltre può essere contenuto all’interno di piccoli filamentic ircolari chiamati Plasmidi.
• Organuli cellulari -> Nei procarioti tutto il materiale utile alla cellula è disperso nel citoplasma, mentre nella cellula eucariotica è compartimentalizzato in vari organelli.
• Ribosomi -> I ribosomi procariotici (70S; 50S + 30S) sono di dimensioni minori rispetto a quelli eucariotici (80S; 60S + 40S).
• Parete cellulare -> La parete cellulare solitamente non è presente nelle cellule eucariotiche superiori, ma nel lievito sì ed è diversa rispetto a quella batterica. Essa è una struttura esterna alla membrana citoplasmatica con funzioni di protezione dalla lisi cellulare (provocata dalla pressione osmotica dovuta alla quantità estrema di soluti all’interno della cellula). La parete conferisce rigidità, forma (una cellula senza parete viene chiamato protoplasma ed è di forma circolare), resistenza agli urti della cellula e la protegge da sostanze tossiche (tossine killer), oltre a selezionare ancora prima della membrana i nutrienti e le sostanze nell’ambiente esterno (soluti > di 600 Da e controllo dell’ingresso d’acqua). Essa può permettere il legame cellula-cellula o cellula substrato solido, oppure può legare uno specifico metallo pesante (catione) per utilizzarlo.

Parete cellulare batterica

La parete cellulare batterica è costituita da:

• Peptidoglicano - Lo strato rigido della parete cellulare, che dona la resistenza della parete stessa, è composto da peptidoglicano: esso è una struttura a rete creata da legami covalenti e non di più molecole biologiche diverse, come una ripetizione dell’unità funzionale. L’unità funzionale del peptidoglicano è il glicante-tetrapeptide: quest’ultimo è formato da 2 zuccheri (N-acetilglucosammina e acido N-acetilmuramico) uniti in uno scheletro glucidico formato da legami beta-1-4-glicosidico; a questa struttura si lega un tetrapeptide composto da 4 amminoacidi in successione legati al secondo zucchero nominato: L-alanina / Acido D-glutammico / DAP o L-lisina / D-alanina. Questa unità funzionale si ripete orizzontalmente (creando nuovi legami glicosidici) e verticalmente (unendo più scheletri glicosidici attraverso legami peptidici tra le catene peptidiche). Il legame peptidico che si forma differenzia le due famiglie di batteri.
  • Gram + - Formano un legame peptidico tra la L-lisina di un tetrapeptide e un ponte di 4/5 monoamminoacidico unito al tetrapeptide di un altro scheletro glucidico. (Tipo e numero di AA caratterizzano specie diverse).
  • Gram - - Formano un legame peptidico tra il gruppo amminico del DAP di un tetrapeptide e il gruppo carbossilico della D-alanina di un altro tetrapeptide.
• Membrana esterna - Essa, come parete cellulare, è una membrana molto simile alla membrana citoplasmatica per la sua composizione e funzione generale, ma se ne differenzia per una molecola fondamentale: il lipopolisaccaride (LPS). Questo LPS è un glicolipide, sostitutivo di molti fosfolipidi nella faccia esterna della membrana esterna, è costituito da acidi grassi (lipide A) come acido caponico (6), aurico (12), miristico (14), palmizio (16), stearico (18) unito al gruppo amminico di un disaccaride costituito da glucosaminafosfato. Questo disaccaride lega il core polisaccaridico che inizia, al quale quindi si lega, con 3 molecole di chetodeossiottonato, legate a loro volta a vari zuccheri (eptosi, glucosio, galattosio e N-acetilglucosammina). In fine dopo il core polisaccaridico vi è la parte finale e caratteristica di ogni specie -> il polisaccaride-O-specifico con gruppi ripetuti molte volte di 3/5 zuccheri variabili tra cui glucosio, galattosio, mannosio, ramnosio, abequoso, paratosio ecc. La membrana esterna contiene molte più porine rispetto a quella interna, le porine sono canali formati da omotrimeri di Beta-foglietto che determinano dei pori centrali per permettere l’ingresso di ioni e soluti. L’ingresso può essere specifico (con molecole d’acqua cosicché può entrare tutto) o specifiche (specifiche per un tipo specifico di soluto o ione).
• Periplasma -> Il periplasma è una zona che si viene a formare tra la membrana citoplasmatica e la parete cellulare, spessa in media 15 nm. Essa si presenta come un gel poiché è piena zeppa di proteine come enzimi litici per la degradazione delle sostanze nutritive, chemorecettori o proteine per il trasporto ABC.

Focus: Differenza della parete cellulare tra Gram + e -

• Gram + - Presenta un peptidoglicano molto spesso formato da legami catalizzato da un ponte di 4/5 AA aggiuntivi. Non presenta membrana esterna e hanno un periplasma molto concentrato. Essendo il peptidoglicano l’unica struttura di rivestimento esterna dei gram +, ad essa sono annesse molecole lipidiche -> acidi teicoici. Queste molecole aiutano la membrana plasmatica nella sua permeabilità selettiva (raggruppano ioni calcio e Magnesio) oltre ad una repulsione per gli agenti patogeni. Alcuni acidi teicoici si posizionano per tutto il peptidoglicano fino ad arrivare alla membrana plasmatica -> acidi lipoteicoici.
• Gram - - Presenta un peptidoglicano molto sottile e formato da legami diretti tra tetrapeptidi. Presenta la membrana esterna con tutte le caratteristiche sopraelencate. Il suo periplasma è abbastanza concentrato, seppur più grande.

Parete cellulare dei lieviti

La parete cellulare dei lieviti è costituita da:

• Strato interno: fitta rete di microfibrille costituite da polimeri di N-acetilglucosammina legati con legami β1-4 chiamati chitina (spesso assente) e polimeri di glucosio lineare con legami β1-3 + ramificazioni β1-6 chiamati glucani. Questo strato permette la vera e propria separazione dall’ambiente esterno, conferendo rigidità e forma al lievito.
• Strato esterno: composta da proteine chiamate mannoproteine o mannani le quali formano i punti di ingresso dei soluti. Essi sono unite a oligosaccaridi (mannosio) i quali possono fungere da recettori.
• Strato periplasmatico: molto simile al periplasma batterico nel quale sono contenuti enzimi e soluti.

FOCUS -> La composizione della parete per i Saccharomyces è molto importante per 2 fenomeni di:

• Flocculazione - Caratteristica legata alle glicoproteine di superficie
• Flottazione - Legata alle caratteristiche di idrofobicità di superficie, in particolare alla capacità di intrappolare la CO₂ in modo da determinare il galleggiamento delle cellule.

Caratteristiche cellulari dei lieviti

La membrana plasmatica ha le caratteristiche della cellula eucariotica: steroli, fosfolipidi e attività di esocitosi (biosintesi parete cellulare) ed endocitosi (sporulazione). Il citoplasma del lievito ha un pH acido pari a 5,2, contiene proteine atte al metabolismo glucidico, amminoacidico e lipidico. Esso contiene i ribosomi come quelli descritti della cellula eucariotica; l’apparato del Golgi per l’assemblaggio proteico; i mitocondri per la produzione energetica; i perossisomi per la detossificazione cellulare (catalasi, ossidasi e alcol ossidasi).

In più alla classica cellula eucariotica possiede sferosomi che sono riserva di lipidi (possono arrivare a rappresentare anche il 60% del peso del lievito) e protesomi che son organuli cellulari adibiti ad attività proteolitica. Il nucleo del lievito possiede le caratteristiche della cellula eucariotica, compreso il nucleolo (rRNA). I lieviti possiedono un numero maggiore di 1 cromosoma, solitamente da 2 a 16 (S. cerevisiae). La lunghezza del DNA varia quindi da 10 a 15 Mb con un range di 5000/10000 geni (probabilmente il numero maggiore di cromosomi indica una maggiore evoluzione del corredo cromosomico). Nel lievito sono o possono essere presenti altre tipologie di DNA: il DNA mitocondriale, contenute all’interno del mitocondrio e che caratterizza la tipologia di lievito; il plasmide Killer o il plasmide derivante da un virus e infine il plasmide circolare selvaggio dei lieviti chiamato in base alla sua lunghezza -> 2 micronm, presente in 60 copie.

La crescita dei lieviti è promossa da specifiche condizioni ambientali: Il pH deve mantenersi nel range 3-8, altrimenti gli acidi organici inibiscono la crescita. L’ossigeno nella maggior parte dei lieviti è necessario alla crescita (organismi aerobi), ma per esempio S. cerevisiae può tranquillamente vivere in assenza di ossigeno (non strettamente anaerobio). La temperatura per i lieviti è molto determinante in quanto la maggior parte sono mesofili (psicrofili solo alcuni lieviti in Antartide). All’interno di questo gruppo possiamo trovare i criotolleranti e i termotolleranti.

L’attività dell’acqua è considerata come il rapporto tra la pressione parziale del vapore dell’acqua in una soluzione e la pressione del vapore dell’acqua pura il tutto ad una certa temperatura. Esso ha un valore che va da 0 a 1, quest’ultimo valore dato esclusivamente dall’acqua distillata (in quanto è 1/1). Esso quindi è un valore inversamente proporzionale alla quantità di soluti della soluzione. Solitamente i lieviti sono osmotolleranti o addirittura osmotici (sono organismi adattati alla vita in ambienti ad alta pressione osmotica, come ad esempio quelli ad alte concentrazioni di zuccheri semplici; l'alta concentrazione di zuccheri è un fattore limitante la crescita di molti microorganismi infatti già dall’antichità veniva usato come metodo di conservazione proprio perché era difficile si sviluppasse vita, gli osmotici però sintetizzano una varietà di composti per proteggersi dall'alta pressione osmotica, come alcoli e aminoacidi).

Tassonomia e classificazione

I microrganismi sono classificati in...