Appunti Biotecnologia delle fermentazioni alimentari

Microrganismi e alimenti

In tutti gli alimenti che subiscono un processo di fermentazione, i microrganismi hanno un ruolo importante (es. nel vino, formaggio, impasti da Saccharomyces cerevisiae, ecc.). È quindi importante gestire sia i processi in cui i microrganismi vengono utilizzati come ceppi (es. yogurt), sia quelli in cui entrano in gioco microrganismi più complessi, magari pure antagonisti l’uno con l’altro.

Quanti microrganismi si ingeriscono

Ingerendo un alimento fresco o fermentato che non ha subito un processo di stabilizzazione termica, si ingeriscono anche microrganismi. Di conseguenza, sarà importante la loro sicurezza; ovvero, tutti i microrganismi inseriti nella catena alimentare non devono creare problemi a livello di salute umana (ovviamente i microrganismi negli alimenti non sono patogeni, ma vi sono “cose” che certi microrganismi portano con sé e che possono essere dannose per la salute).

Importante è capire anche quanti microrganismi si ingeriscono; ad esempio, nello yogurt si hanno Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Se si coltivano i due microrganismi singolarmente nel latte, essi crescono fino a una certa densità cellulare, mentre insieme arrivano a densità cellulare più elevata (scambio di prodotto) in quanto si ha un sinergismo positivo tra essi. È importante usare il termine densità cellulare e non concentrazione quando si parla di microrganismi, in quanto essi stanno in sospensione e non si sciolgono nel solvente.

Il mondo dei probiotici

Dal punto di vista commerciale, i probiotici sono estremamente importanti in quanto danno un valore aggiunto maggiore rispetto alla biomassa utilizzata per produrre yogurt, mozzarella, ecc. (in quanto il target generato con il probiotico si avvicina alla farmacia; disegnato e progettato per migliorare la salute e il benessere degli individui). A parità di costo di biomassa, la biomassa di tale probiotico viene pagata maggiormente di un innesto per realizzare lo yogurt.

Le muffe, allo stesso modo, vengono ingerite vive e vanno incontro al tratto gastro-intestinale, dove si ha la barriera gastrica che può fungere da abbattitore (non per tutti; alcuni svolgono attività anche nell’intestino). La stessa cosa vale per i patogeni: un alimento con patogeni crea problemi nell’intestino se essi non vengono abbattuti dalla barriera gastrica. Il Penicillium viene, ad esempio, utilizzato per formaggi erborinati, però in un contesto diverso può costituire un elemento alterativo oppure può produrre una tossina.

Ecologia microbica

Quando si parla di microbiologia alimentare, si sta entrando di fatto nell’ecologia microbica (un alimento non contiene mai solo il microrganismo; es. latte pastorizzato che contiene altra componente microbica). Al fine di gestire al meglio le condizioni di crescita e le attività metaboliche dei microrganismi per l’ottenimento degli alimenti, è quindi fondamentale l’identificazione tassonomica di tutte le specie presenti.

Si può avere una popolazione di thermophilus ma con individui diversi, che acidificano in modo diverso. Si può avere una diversità microbica nella materia prima, ma una popolazione diversa nel prodotto finito e non bisogna sapere quante e quali specie ci sono ma quanta specie c’è rispetto a un’altra. Le specie dominanti, infatti, grazie all’attività metabolica fanno una certa cosa mentre altre specie intervengono di meno.

La superficie dei formaggi (Taleggio e Gorgonzola), ad esempio, è un ambiente aerobio e molto salato; scendendo, l’ambiente sarà meno aerobio comportando una diversità di comunità microbiche. La crosta di Taleggio e Gorgonzola è un ambiente in cui sta bene Listeria monocytogenes: nelle etichette viene indicato che la crosta del Gorgonzola non è edibile ma tagliando la fetta si trascina all’interno ciò che stava sulla crosta. Bisogna fare in modo che non cresca tramite soluzioni in cui si aggiungono volontariamente microrganismi sulla crosta che fungono da competitors per Listeria.

L’applicazione di microrganismi per controllarne altri in ambito alimentare ha sempre più importanza, anche perché limitano l’utilizzo della chimica (es. conservanti). Si ha lo sviluppo, infatti, di colture di protezione, ovvero lo sviluppo di microrganismi che controllano quelli indesiderabili o addirittura patogeni.

Caratterizzazione delle attività metaboliche di interesse tecnologico

La descrizione qualitativa e quantitativa delle specie in un ambiente la si affronta con metodologie sofisticate; ad esempio, si estrae il DNA dalle matrici e lo si sequenzia per capire quali specie ci sono e quali sono le relazioni tra queste. La valutazione del grado di diversità biologica rimane sempre una stima della reale diversità microbica esistente sia per la difficoltà di recuperare le specie presenti a bassa concentrazione nel campione, sia per l’annoso problema delle specie non coltivabili.

Se nella matrice c’è uno Streptococcus thermophilus piuttosto che Saccharomyces cerevisiae si possono avere informazioni su cosa potrebbe succedere nell’alimento (si ha l’informazione sul metabolismo primario). Quello che non si conosce sono quei metabolismi secondari non caratteristici della specie ma dell’individuo. Bisogna quindi arrivare a una caratteristica fenotipica di interesse tecnologico, tipica dei singoli ceppi piuttosto che della specie.

Ad esempio, utilizzando batteri lattici con attività contro i microrganismi patogeni, le loro caratteristiche sono tendenzialmente scovabili confrontando un ceppo con l’altro (si sta parlando di variabilità intraspecie). Metabolismo lattosio/galattosio: nello yogurt entrambe le specie usano lattosio, però all’interno della specie thermophilus c’è un ceppo che usa più velocemente o meno il lattosio, acidificando di conseguenza più velocemente o meno.

In funzione del processo tecnologico ci interesserà di più un ceppo dell’altro. Ad esempio, si può volere elevata velocità di utilizzo del lattosio ma se d’altra parte gli individui usano lentamente aminoacidi, essi crescono di meno: bisogna comunque cercare tra gli individui quello più dotato di sistemi proteolitici differenti (perché ciò significa che crescono più velocemente e che quindi acidificano anche più velocemente).

Durante la maturazione di un formaggio avvengono delle reazioni enzimatiche che portano alla produzione di aromi, i quali migliorano le caratteristiche sensoriali di un prodotto. Si tratta di enzimi endocellulari, quindi, a volte è necessario che i microrganismi si lisino nella matrice. Si può anche avere la produzione di polisaccaridi esocellulari: lo yogurt privo di sostanza grassa, ad esempio, ha meno calorie ma non avrà la stessa cremosità ottenuta con il latte intero. Ciò viene risolto con ceppi di thermophilus con la capacità di produrre e rilasciare esopolisaccaridi che trattengono meglio le molecole acqua creando viscosità o cremosità dello yogurt senza aumentare il potere calorico del prodotto, in quanto non vengono digeriti dai sistemi del nostro organismo.

Si cercano anche molecole con attività antibatterica/antifungina: caso in cui si utilizzano microrganismi per controllarne altri. Si usano i microrganismi che hanno ruolo fondamentale nella fermentazione oppure si usano colture di protezione. Se la coltura starter selezionata non produce molecole con attività antimicrobica è necessario aggiungere la coltura di protezione, che però non deve farsi notare (non deve interferire con le caratteristiche sensoriali del prodotto). Selezione micro con attività di protezione e con attività metabolica prossima allo zero ma comunque efficiente per ridurre allo zero gli alteranti o i patogeni.

L’altro fattore importante è che questi microrganismi vanno prodotti se devono essere utilizzati: produrli a livello industriale significa utilizzare fermentatori grandi (si parla di batteri soggetti ad attacchi virali). Ciò che bisogna valutare nei ceppi batterici che si commercializzano è la resistenza ai batteriofagi. Tra i ceppi di thermophilus bisogna conoscere la loro sensibilità ai più comuni batteriofagi presenti nei prodotti caseari. Si hanno infatti due tipologie di danni: sensoriale (illimpidimento per lisi) e danno commerciale (non succede nulla; non si ha acidificazione). Ciò richiede quindi degli screening a livello di ceppo, ovvero avere dei protocolli di laboratorio che consentano di avere caratteristiche di un elevato numero di cellule.

Quando vengono venduti microrganismi per fare qualcosa, questi non vengono quantificati (si ha solo un’unità funzionale/tecnologica; definite unità caldaia, ovvero la quantità di micro che consente di ottenere un determinato pH, in una certa quantità di prodotto e in un determinato tempo).

Mercato probiotici: la legislazione chiede di dichiarare il numero di cellule vive del prodotto e che devono rimanere vive durante l’intera shelf life ma in realtà nessuno controlla questo, ci sono solo studi scientifici. D’altra parte, ci sono gli starter con valore commerciale minore ma la cui attività è ben chiara e ben misurata.

Un microrganismo che cresce nel latte non deve per forza usare il lattosio: per il lattosio ci deve essere un sufficiente sistema di trasporto, il lattosio deve essere scisso dalla galattosidasi, il glucosio viene utilizzato e il galattosio invece si accumula nella matrice in quanto non utilizzato.

Ci sono addirittura dei casi in cui si selezionano delbruekii che non sono in grado di utilizzare il lattosio: necessità legata a un problema tecnologico definito post-acidificazione. Si pone il latte in condizioni di temperatura idonee per le diverse trasformazioni e poi il latte viene raffreddato. Mantenendo la catena del freddo, l’attività metabolica viene rallentata e il problema sorge quando lo yogurt viene trasportato.

Quando la temperatura sale al di sopra di certi valori, i microrganismi continuano a consumare zucchero e produrre acido lattico (soprattutto delbruekii che è quello meno thermophilus). Quindi, si usano ceppi che non utilizzano il lattosio (solo glucosio) in modo da non acidificare poi ulteriormente il prodotto.

Delbruekii, inoltre, ha proteasi extra-cellulari più efficienti (idrolisi di piccole porzioni di caseina formando peptidi che servono al thermophilus stesso): si liberano quindi peptidi che contengono aminoacidi idrofobici, i quali conferiscono un sapore amaro. Il fenomeno di post acidificazione dello yogurt è legato anche alla formazione di questi peptidi (altro motivo per il quale si selezionano ceppi non in grado di utilizzare lattosio).

Il sistema proteolitico è importante anche per il rilascio di peptidi bioattivi, come ad esempio la produzione di angiotensinogeno II (vasocostrittore per controllo pressione sanguigna), oppure produzione peptidi che legano il ferro per migliorare l’assorbimento intestinale, ecc. Si tratta di sequenze amminoacidiche che si trovano principalmente nelle caseine.

Meccanismi di trasporto

Come la cellula riesce a migliorare l’efficienza del trasporto dei nutrienti (regolazione).

Il primo passaggio avviene attraverso la membrana cellulare per diffusione (vincolo di ingresso), la quale consente il passaggio solo di alcune tipologie di molecole (anfifiliche; in grado di sciogliersi nel doppio strato fosfolipidico). Non si tratta però di trasporto, in quanto esso avviene attraverso proteine/complessi di proteine. Tutto ciò che ha una carica/polarità non può passare attraverso la membrana se non tramite sistemi di trasporto (quindi ciò vale anche per lipidi, proteine e aminoacidi). Nel caso di peptidi si hanno anche limiti di dimensione, ad esempio possono essere trasportati fino a 10 aminoacidi (nei batteri lattici si arriva anche a dimensioni intorno ai 20-30 aminoacidi) e tutto ciò che ha dimensioni maggiori necessita di riduzione di dimensioni. Quindi, al di fuori della cellula deve esserci attività proteolitica per ottenere peptidi, oppure glucosidasica per ridurre le dimensioni dei polisaccaridi e ottenere monosaccaridi.

• PEP-PTS: funziona con un complesso di proteine, in cui si ha una proteina trans-membrana che garantisce la specificità nei confronti dello zucchero (ovvero, da tale sistema di trasporto entra uno zucchero e uno solo in funzione della proteina trans-membrana presente). Il passaggio all’interno della cellula richiede comunque un dispendio di energia, il quale viene favorito dalla traslocazione di un fosfato allo zucchero in ingresso, a partire dal fosfoenolpiruvato (se lattosio, diventa lattosio-fosfato). Quindi, il passaggio del fosfato allo zucchero avviene attraverso 3 fosfotransferasi e grazie al donatore del gruppo fosfato, ovvero il PEP. Diventa evidente il legame tra il metabolismo energetico principale e il sistema di trasporto: se viene sacrificata una molecola di PEP per far entrare uno zucchero nella cellula, ciò significa che il catabolismo di questo zucchero e il suo trasporto sono strettamente collegati. In realtà, quasi tutte le attività cataboliche e anaboliche della cellula sono strettamente legate l’una con l’altra; quindi, devono anche esistere sistemi di regolazione dei trasportatori. Il passaggio dello zucchero che entra nella cellula grazie al consumo di una molecola di PEP, è quello con cui la glicolisi raggiunge un bilancio positivo di +2ATP; quindi, significa che avere un trasporto di tale tipo riduca la resa di ATP della glicolisi? NO, la glicolisi finisce con un +2, ovvero entra un glucosio, si ha fosforilazione consumando 2 molecole di ATP, poi il glu-6 viene trasformato in glu-3 e ciascuna di queste molecole diventa PEP. Infine, ogni PEP genera una molecola di ADP e alla fine il bilancio energetico è di +2 molecole (si hanno 2 molecole consumate e 4 generate). Se avviene la sottrazione per il sistema di trasporto, la resa energetica comunque non sarà inferiore in quanto non si consuma ATP a monte per fosforilare lo zucchero (lo si consuma solo a valle per il PEP). Il trasporto non incide di conseguenza sul bilancio energetico della glicolisi.
• Sinporto: solitamente è coinvolta una sola proteina e per l’ingresso dello zucchero si sfrutta il passaggio di protoni ⁺ secondo gradiente di qualcosa che è più abbondante all’esterno della cellula (es. protoni ⁺). Nel caso del lattosio, esso viene così portato all’interno della cellula. Apparentemente questo sistema non comporta un consumo di energia ma bisogna anche considerare che la cellula, per essere vitale, necessita di mantenere un gradiente di protoni a cavallo della membrana ma anche per mantenere il corretto pH intracellulare (quando sparisce la differenza di potenziale, la cellula di fatto è morta). Di conseguenza, la membrana cellulare, grazie alla sua caratteristica di impermeabilità anche a un singolo protone, fa sì che possa mantenere il pH fisiologico pompando all’esterno protoni, mantenendo anche così un gradiente. I protoni possono rientrare nella cellula solo grazie ai sistemi di trasporto. Nella catena di trasporto degli elettroni si ha continua espulsione di protoni all’esterno, ma nel caso di microrganismi che non respirano e non hanno tale catena, l’unica possibilità che hanno per espellere protoni all’esterno è quello di consumare ATP. Per fare ciò interviene l’ATPasi che gestisce il pH intracellulare e garantisce la differenza di potenziale a livello di membrana. La cellula, quindi, consuma zucchero e ricava energia per mantenere la differenza di potenziale. La proteina transmembrana coinvolta è una lattosio-permeasi, la quale “galleggia” nel doppio strato fosfolipidico (espone una parte verso l’interno e l’altra verso l’esterno della cellula). Tale proteina, quando scarica, espone due siti di riconoscimento per lattosio e per i protoni all’esterno e ciò che succede, è che l’interazione di tale proteina, prima con i protoni e poi con il lattosio, comporta un cambiamento della conformazione (si ribalta all’interno). Succede di conseguenza che il pH intracellulare è diverso, generando separazione dei protoni dal sito e anche il distacco del lattosio. Infine, la proteina scarica torna a ribaltarsi verso la superficie della cellula.

Si può intervenire uccidendo la cellula: se è la membrana che determina la separazione allora rompendola si fa saltare la differenza di potenziale. Si può ad esempio esercitare rottura di tipo meccanico oppure agire attraverso stress termici (es. pastorizzazione o sterilizzazione) si impedisce la separazione di cariche, uccidendo la cellula. Si possono anche usare delle molecole che destrutturano la membrana, quali detergenti (es. sali biliari tensioattivi; infatti, molti probiotici vengono anche selezionati in funzione di come sono resistenti agli acidi biliari). Esistono anche altre molecole come biocidi (disinfettanti) le quali agiscono non specificamente verso target molecolari della cellula (come gli antibiotici) ma agiscono su un target più ampio (spesso agiscono sulle membrane; es. ipoclorito di sodio). Altre molecole legano i protoni mascherando la loro carica positiva, garantendone così la permeabilità (protonofori; es. peptide granicidina).

Infine, si possono avere le batteriocine (piccoli peptidi prodotti da batteri verso altri batteri), creano pori/canali (dai quali fuoriescono soluti, ioni, ecc.) nella membrana facendo saltare la differenza di potenziale; questi si possono anche usare in concentrazioni...