Vettori genetici: plasmidi, batteriofagi e innovazioni moderne

Sono mezzi usati per portare il DNA esogeno all’interno delle cellule ospiti, sono in grado di replicarsi e di essere trasmessi alle cellule figlie. I tre principali sono:

-Plasmidi;

-DNA dei batteriofagi;

-Vettori di espressione.

Caratteristiche dei plasmidi

Plasmidi: Sono molecole di DNA extra-cromosomiche circolari e sono usati anche perché contengono geni di vantaggio selettivo (geni resistenza antibiotici).

-ORI, origine di replicazione;

-Sito unico di taglio per ogni enzima di restrizione;

-Marcatore selezionabile, cioè un carattere che rende il plasmide differente dagli altri, tipo vantaggio selettivo;

-Sito per le rimozione del gene inserito, situato generalmente poco più a monte e poco più a valle del gene;

Sono in grado di replicarsi autonomamente rispetto al DNA cromosomiale. Inoltre possono essere facilmente separati dal resto del DNA e purificati.

Funzionamento dei batteriofagi

Batteriofagi: Sono virus che infettano i batteri, di dimensioni più grandi rispetto agli altri (200 nm). Possono compiere il cilo litico o lisogeno. Nel litico i fagi distruggono le cellule per uscirne e infettarne altre, nel lisogeno il DNA virale si integra con quello delle cellule figlie e viene trasmesso alla progenie, poi può avvenire il litico.I fagi trasportano più DNA dei plasmidi, ma sono meno maneggevoli. Tra i batteriofagi il più usato il Fago lambda, che compie ciclo lisogeno. Tuttavia i vettori derivati dal fago lambda vengono modificati per rendere possibile solo il iclo litico, per evitare l’integrazione del fago al genoma cellulare e avere direttamente la produzione delle particelle virali ricombinanti.

Vettori di espressione e loro utilizzo

Vettori di espressione: Simili ai plasmidi, permettono di innescare la reazione di espressione dei geni presenti nel vettore, e quindi sono molto utili per la distinzione dei geni. La differenza tra plasmidi e vettori di espressione risiede nel fatto che i vettori di espressione presentano un promotore molto forte. Presentano alcune caratteristiche:

-Sito per dare inizio alla trascrizione del mRNA (promotore) e per terminarla (terminatore);

-Sito per dare inizio alla traduzione dell’mRNA in proteine.

Altri vettori di più recente introduzione sono i cosmidi, i vettori BAC, PAC e YAC.

Cosmidi:Più sofisticati e capienti dei precedenti, sono ottenuti da manipolazione in laboratorio di plasmidi e fagi. Si caratterizzano perché: presentano dei siti cos, che contengono infromazioni per far produrre il capside,e compiono l’infezione della cellula come se fossero fagi. Però una volta all’interno della cellula si comportano come plasmidi, quindi la selezione e l’analisi deve essere effettuata con le tecniche relative a questi ultimi vettori. Nonostante la presenza di plasmidi, fagi, cosmidi, vettori di espressione vi era la necessità di sviluppare vettori in grado di accettare grossi inserti di DNA. Dal 1992 sono disponibili:

Descrizione dei PAC

PAC (P1 derived Artivicial Chromosome) : Contengono al loro interno il sito pac, che serve per impaccare il DNA attorno alle proteine, e due siti loxP, che portano alla circolarizzazione del DNA impaccato nei capsidi quando viene iniettato all’interno di una cellula ospite.

Caratteristiche dei BAC

BAC (Bacerial Artificial Chromosome): Derivano dal fattore sessuale F di E. Coli, possono essere introdotti nelle cellule sfruttando la trasformazione, e possono contenere DNA umano o vegetale, permettendo di propagarlo per almeno 100 generazioni.

YAC e dimensioni degli inserti

YAC (Yeast Artificial Chromosome): Derivano dai lieviti, organismi eucariotici. Sono in grado di contenere frammenti di DNA più grandi.

-Dimensione dell’inserto contenuto nei principali vettori:

• V. plasmidici: 0-10 kb

• V. fago lambda: fino a 23 kb

• V. cosmidici: 30-44 kb

• V PAC: 130-150 kb

• V. BAC: fino a 300 kb

• V. YAC: da 200 a 2000 kb