Tecniche di analisi e manipolazione del DNA: dalla fluorescenza alla centrifugazione

Assorbimento UV degli acidi nucleici

Gli acidi nucleici hanno la caratteristica di assorbire la luce UV a 260 nm, ciò è dovuto alla presenza del sistema degli anelli che sono costituiti da purine e pirimidine. A 260 nm ci permette di distinguere assorbimento di DNA nel suo quantitativo di proteine. Tramite la fluorimetria si misura il DNA utilizzando criteri di fluorescenza.

Fluorimetria e etidio bromuro

L’etidio bromuro è una molecola piatta che si va a intercalare tra filamenti della doppia elica, l’intercalandosi fa si che si crei questo legame che forma dimeri di timine, TT anomali, ha la caratteristica che questa molecole emette fluorescenza arancione colpita da luce a 320 nm. Si usa per colorare il DNA, tecnica utilizzata nel elettroforesi.

Centrifugazione e analisi molecolare

Si può studiare in una sostanza ad alto peso molecolare. Usando una sostanza densa e mettendo una molecola di interesse sopra la sostanza, la molecola messa va in centrifuga e si muoverà all'interno del fluido denso in base alla sua conformazione e al peso molecolare. Il modo in cui migra nella sostanza densa ci da l’idea della sua lunghezza, della sua composizione di basi e della sua conformazione (singolo filamento, doppio, circolare, lineare, superavvolta, rilassata).

Si effettua quindi un’analisi indiretta della struttura della molecola.

Miscele di acidi nucleici possono essere separate mediante processi di centrifugazione in gradienti di concentrazione.

Centrifugazione in gradiente di densità

La centrifugazione per velocità in gradiente di densità. La velocità di sedimentazione è definita in unità chiamate coefficiente di Svedberg. In un gradiente denso, si va a misurare la posizione di equilibrio cioè ad un certo punto la molecola troverà un punto di equilibrio nella sostanza densa e si fermerà. Il suo punto di equilibrio è dipendente da lunghezza, conformazione e composizioni in basi. 

La centrifugazione all’equilibrio in gradiente di densità tipico (cesio cloruro), permette la separazione di componenti di questa sostanza. Si mette una sostanza densa e sopra una sostanza di ignoto, si effettua la centrifugazione e si va a separare nelle sue componenti, si può misurare l’assorbanza e si osserva che c’è qualcosa di organico. Utilizzata per studiare la composizione in basi del DNA.

Denaturazione e rinaturazione del DNA

In laboratorio si può denaturare molto facilmente, variando temperatura o pH. I legami idrogeno di una doppia elica possono essere rotti se la molecola è portata alla temperatura di fusione (melting) ovvero la  temperatura alla quale un filamento di DNA risulta al 50% denaturato.

Tm = 4GC +2AT -5.

Formula che considera maggiormente il contenuto in GC che in AT,  ovvero serve temperatura maggiore per denaturare la doppia elica ricca in GC.

I legami idrogeno si ricostituiscono se la temperatura viene abbassata lentamente ricostituendo la doppia elica di DNA.

Questo  perché il filamento è appiccicoso e cerca il suo complementare. Si ottiene quindi il DNA rinaturato. 

Questa tecnica è utilizzata molto per: identificare regioni specifiche del genoma complementare ad un RNA o ad un tratto di DNA, e studiare la complessità dei genomi.