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Sequenziamento del DNA


Il materiale genetico è conservato per fare ricerca. Per sequenziamento si intende il tentativo di leggere nucleotide dopo nucleotide tutte le informazioni contenute nel DNA. Sanger ha avuto il nobel per questa scoperta. Il metodo Sanger è stato scoperto negli anni ’70.

Sanger ha ricostruito la sequenza dell’insulina e ha inventato un metodo di sequenziamento che ha consentito di leggere il genoma umano. Per ciascuna di queste scoperte ha vinto il Nobel.
Sono poi state sviluppate tecnologie più veloci per attuare il sequenziamento più rapidamente. Si è scoperto comunque che c’è un grande mistero nel DNA. Il metodo Sanger è basato su dei nucleotidi dideossinucleotidi (ddNTPs); essi cambiano a seconda del nucleotide. Essi sono utilizzati in un contesto in cui funzionano da segnale. Essi non vengono riconosciuti dalla DNA polimerasi, che si blocca. A questo punto si taglia il DNA con gli enzimi di restrizione per analizzarlo in più parti, si mette lo stesso campione in 4 provette diverse. In ognuna si aggiunge una serie di ddNTPs specifici per ogni base azotata. A quel punto i primer (quelli legati al tipo di sequenza determinata dall’enzima di restrizione utilizzato per tagliare).

I metodi moderni di sequenziamento sono basati su dei macchinari che riescono a svolgere i processi che faceva Sanger. Non si utilizzano più i dideossinucleotidi, ma dei gruppi fluorescenti legati a tutti i nucleotidi, ma con colori diversi a seconda della base azotata. Si legano alla sequenza di DNA delle etichette, brevi sequenze legate con DNA ligasi. Si usano poi primer complementari alle etichette in maniera he l’innesco sia lo stesso per tutti i segmenti. La DNA polimerasi duplica i segmenti di DNA prodotti e ogni volta che incontra i gruppi fluorescenti, interrompe la duplicazione. La macchina rivela il nucleotide, che però non rimane; c’è un reagente che lo fa staccare; la duplicazione riprende. Viene quindi letto tutto il campione e la macchina riesce a registrare nucleotide dopo nucleotide, la sequenza. Ciò non è fatto su tutto il DNA del cromosoma; si prendono diverse sequenze.
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