Sequenziamento, Metodo dideossi

Genetica – Sequenziamento, Metodo dideossi

Con la tecnica del sequenziamento è possibile determinare in modo semplice e veloce la sequenza nucleotidica di un segmento di DNA. Grazie a questa metodica è stata determinata la sequenza di centinaia di migliaia di geni. I genomi di alcuni organismi, come quello del moscerino della rutta Drosophila melanogaster, quello del lievito Saccharomyces cerevisiae e anche quello dell’uomo, sono stati interamente sequenziati.

Esistono metodi diversi per il sequenziamento, ma il più utilizzato è il metodo difesosi, che si basa sulla sintesi di DNA in vitro, in presenza di dideossiribonucleosidi trifosfati terminatori di catena. Viene utilizzato l’enzima DNA polimerasi per produrre copie parziali del frammento di DNA da sequenziare; ogni nuovo filamento di DNA sintetizzato si interrompe a livello di un certo nucleotide (A, G, C o T). Al termine del processo si ottengono segmenti di DNA che differiscono tra lo o per un solo nucleotide. Le copie vengono separate mediante elettroforesi su gel e la sequenza del DNA originale emerge dall’ordine di questi frammenti. Oggi questo metodo è totalmente automatizzato: dispositivi meccanici mescolano i reagenti e fanno migrare le copie di DNA su gel, leggendo poi in automatico l’ordine dei nucleotidi. Una volta ottenuta la sequenza di un determinato segmento di DNA, sorge il problema di identificare con precisione i geni che vi sono localizzati e scoprire la loro funzione. Individuare la posizione dei geni nei genomi batterici è più semplice, poiché i cromosomi sono privi di intro-ni (sequenze non codificanti); generalmente si vanno a cercare sequenze particolari, come le triplette di inizio (di solito ATG) e di terminazione (TAA; TAG; TGA) dei Geni. Per i genomi più complessi, come quelli di piante e ani-mali, il lavoro diventa molto più complicato, per la presenza di introni, spesso di grandi dimensioni, inseriti tra le regioni codificanti dei geni, gli esoni. Può essere utile individuare i segmenti di conine tra introni ed esoni, o confrontare le sequenze di DNA con il DNA di organismi imparentati. Gli esoni, infatti, si conservano nel corso dell’evoluzione, mentre gli introni sono soggetti a mutazioni continue.