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I plasmidi e i fagi sono agenti della donazione genica


Sperimentalmente ci si serve dell’inserimento di un determinato gene in un plasmide per ottenere molte copie (clone) del gene desiderato.
In una prima fase della donazione genica si isolano un plasmide (vettore di clonaggio) e il DNA recante il gene desiderato. Nella clonazione genetica il gene da clonare appartiene a una molecola di DNA eucariotico.
Successivamente sia il plasmide sia il DNA eucariotico vengono trattati con uno stesso enzima di restrizione,che taglia le molecole liberando estremità coesive; si isola il frammento del DNA eucariotico recante il gene da donare.
Il plasmide e il frammento del DNA eucariotico vengono messi in contatto e le estremità coesive del plasmide si legano covalentemente con quelle del
frammento di DNA; l’enzima DNA-ligasi rende stabile il legame.
Il plasmide ricombinante viene aggiunto a una coltura batterica e introdotto in questo modo in una cellula batterica, che lo replica ad ogni divisione.
Con la riproduzione batterica coincide così la vera donazione del gene: il batterio dividendosi forma un clone cellulare e il gene inserito nel plasmide ricombinante viene a sua volta donato.
Quando il vettore di donazione è rappresentato da DNA virale, il gene desiderato viene inserito nei DNA di un fago, digerito con un enzima di restrizione; il DNA ricombinante viene poi introdotto in cellule di E. coli ove si replica, formando un clone di fagi, che recano il gene in esame
La donazione genica può avvenire anche utilizzando colture di cellule eucariotiche in vitro: in tal caso il DNA ricombinante viene introdotto nelle cellule attraverso microiniezioni oppure mediante elettroporazione, procedimento che procura l’apertura di pori della membrana plasmatica mediante il passaggio di un impulso elettrico in una soluzione contenente le cellule.
Per le cellule vegetali, che in coltura si prestano molto facilmente alle manipolazioni genetiche, si usa la “pistola genica”, ovvero si spara nelle cellule il DNA da donare, adeso a particelle microscopiche metalliche.
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