Concetti Chiave
- I plasmidi e i fagi sono utilizzati per la clonazione genica, permettendo la replicazione del gene desiderato.
- Il processo inizia isolando un plasmide e il DNA contenente il gene da clonare, trattati con lo stesso enzima di restrizione per creare estremità coesive.
- Il DNA-ligasi stabilizza il legame tra il plasmide e il frammento di DNA, formando un plasmide ricombinante inserito in cellule batteriche per la replicazione.
- Quando si utilizza un fago come vettore, il gene viene inserito nel DNA virale e introdotto in cellule di E. coli per formare un clone di fagi.
- In colture cellulari eucariotiche, il DNA ricombinante può essere introdotto tramite microiniezioni, elettroporazione o con la "pistola genica" nelle cellule vegetali.
Sperimentalmente ci si serve dell’inserimento di un determinato gene in un plasmide per ottenere molte copie (clone) del gene desiderato.
Processo di clonazione genetica
In una prima fase della donazione genica si isolano un plasmide (vettore di clonaggio) e il DNA recante il gene desiderato. Nella clonazione genetica il gene da clonare appartiene a una molecola di DNA eucariotico.
Successivamente sia il plasmide sia il DNA eucariotico vengono trattati con uno stesso enzima di restrizione,che taglia le molecole liberando estremità coesive; si isola il frammento del DNA eucariotico recante il gene da donare.
Il plasmide e il frammento del DNA eucariotico vengono messi in contatto e le estremità coesive del plasmide si legano covalentemente con quelle del
frammento di DNA; l’enzima DNA-ligasi rende stabile il legame.
Il plasmide ricombinante viene aggiunto a una coltura batterica e introdotto in questo modo in una cellula batterica, che lo replica ad ogni divisione.
Con la riproduzione batterica coincide così la vera donazione del gene: il batterio dividendosi forma un clone cellulare e il gene inserito nel plasmide ricombinante viene a sua volta donato.
Tecniche di donazione genica
Quando il vettore di donazione è rappresentato da DNA virale, il gene desiderato viene inserito nei DNA di un fago, digerito con un enzima di restrizione; il DNA ricombinante viene poi introdotto in cellule di E. coli ove si replica, formando un clone di fagi, che recano il gene in esame
La donazione genica può avvenire anche utilizzando colture di cellule eucariotiche in vitro: in tal caso il DNA ricombinante viene introdotto nelle cellule attraverso microiniezioni oppure mediante elettroporazione, procedimento che procura l’apertura di pori della membrana plasmatica mediante il passaggio di un impulso elettrico in una soluzione contenente le cellule.
Per le cellule vegetali, che in coltura si prestano molto facilmente alle manipolazioni genetiche, si usa la “pistola genica”, ovvero si spara nelle cellule il DNA da donare, adeso a particelle microscopiche metalliche.
Domande da interrogazione
- Qual è il ruolo dei plasmidi nella donazione genica?
- Come avviene l'inserimento del gene desiderato nei plasmidi?
- Quali metodi vengono utilizzati per introdurre il DNA ricombinante nelle cellule eucariotiche?
I plasmidi servono come vettori di clonaggio per inserire e replicare un gene desiderato, facilitando la creazione di molte copie del gene attraverso la clonazione genetica.
Il plasmide e il DNA eucariotico vengono trattati con lo stesso enzima di restrizione per creare estremità coesive, che si legano covalentemente con l'aiuto dell'enzima DNA-ligasi, formando un plasmide ricombinante.
Il DNA ricombinante può essere introdotto nelle cellule eucariotiche tramite microiniezioni, elettroporazione o, nel caso delle cellule vegetali, utilizzando una "pistola genica" che spara il DNA adeso a particelle metalliche.
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