Concetti Chiave
- Il clonaggio genico permette di produrre grandi quantità di un segmento di DNA specifico, semplificando la ricerca di un gene attraverso la suddivisione del DNA in frammenti gestibili.
- I frammenti di DNA vengono inseriti in vettori plasmidici, come il BAC, e clonati in Escherichia coli per formare una genoteca genomica.
- La genoteca genomica consente l'uso di sonde specifiche per individuare cloni contenenti il gene d'interesse attraverso l'ibridazione.
- Le genoteche di cDNA si differenziano dalle genomiche poiché contengono DNA derivato da mRNA, escludendo introni e includendo solo sequenze codificanti.
- La genoteca di cDNA varia a seconda del tessuto da cui viene estratto l'mRNA, poiché i diversi tessuti producono differenti molecole di mRNA.
Con il clonaggio genico è possibile, produrre grandi quantità di un determinato segmento di DNA.
Come possiamo identificare uno specifico gene che vogliamo clonare?
Indice
Processo di frammentazione del DNA
Viste le enormi dimensioni della molecola di DNA, per rendere più semplice la ricerca di un gene che si vuole clonare, il primo passo consiste nel suddividere il DNA genomico in frammenti più piccoli, che possano essere maneggiati più facilmente. Uno dei procedimenti più utilizzati consiste nell’estrarre il DNA da un tessuto e nel tagliarlo con una nucleasi di restrizione, formando migliaia di frammenti. In condizioni sperimentali adeguate si inserisce ognuno dei frammenti in un vettore plasmidico adatto. Il vettore generalmente utilizzato in queste procedure è chiamato BAC (cromosoma artificiale batterico), un vettore plasmidico di Escherichia coli. I plasmidi ricombinanti vengono messi in una coltura di Escherichia coli a una concentrazione tale da far sì che ogni batterio inglobi un solo plasmide. Tutti i frammenti vengono così clonati e nel loro insieme formano una genoteca genomica.
Utilizzo di sonde per l'identificazione
Come si fa a trovare un gene in questa libreria composta da tutti i frammenti clonati?
Si può utilizzare una specifica sonda, complementare al gene che cerchiamo, e farla ibridare con i nostri frammenti, in modo da individuare il clone corretto. A seconda del tipo di tecnica utilizzata per frammentare il DNA genomico, si possono costruire molte genoteche genomiche diverse.
Genoteca di cDNA e differenze
Un altro tipo di banca del DNA è la genoteca di cDNA (DNA complementare). Anch’essa, come quella genomica, è composta da cloni di frammenti di DNA, ma con una differenza sostanziale: il DNA di una genoteca di cDNA non è DNA genomico ma DNA copiato da RNA messaggeri estratti da uno specifico tessuto. Per preparare una genoteca di cDNA si estrae l’mRNA dalle cellule e, utilizzando la tascrittasi inversa, si copiano, ottenendo così molecole di DNA complementare (cDNA). Questi cDNA vengono poi clonati come i frammenti delle genoteche genomiche, per produrre una genoteca di cDNA. Poiché le cellule dei vari tessuti producono differenti molecole di mRNA, per ogni tipo di tessuto si otterrà una diversa genoteca di cDNA. Un’importante differenza tra i due tipi di librerie del DNA è che le genoteche genomiche contengono grandi quantità di introni, mentre i cloni di cDNA contengono solo sequenze codificanti.
Domande da interrogazione
- Come si identifica un gene specifico da clonare nel DNA genomico?
- Qual è la differenza principale tra una genoteca genomica e una genoteca di cDNA?
- Come si prepara una genoteca di cDNA?
Per identificare un gene specifico, il DNA genomico viene suddiviso in frammenti più piccoli utilizzando una nucleasi di restrizione. Questi frammenti vengono inseriti in vettori plasmidici, come il BAC, e clonati in Escherichia coli per formare una genoteca genomica. Una sonda complementare al gene di interesse può essere utilizzata per individuare il clone corretto.
La differenza principale è che una genoteca genomica contiene frammenti di DNA genomico, inclusi introni, mentre una genoteca di cDNA è composta da DNA complementare copiato da mRNA, contenendo solo sequenze codificanti senza introni.
Per preparare una genoteca di cDNA, si estrae l'mRNA dalle cellule di un tessuto specifico e si utilizza la trascrittasi inversa per copiare l'mRNA in cDNA. Questi cDNA vengono poi clonati per formare la genoteca di cDNA, che varia a seconda del tipo di tessuto da cui proviene l'mRNA.
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