Concetti Chiave
- Il processo di clonazione del DNA prevede l'uso di una endonucleasi di restrizione per tagliare il plasmide e il gene d'interesse, facilitando così l'inserimento del gene nel plasmide.
- La DNA ligasi è essenziale per formare molecole di DNA ricombinante, unendo frammenti di DNA attraverso legami covalenti e ricostruendo l'ossatura zucchero-fosfato.
- Questo enzima permette di combinare DNA da organismi diversi, creando molecole non presenti in natura, e viene frequentemente utilizzato nella tecnologia del DNA ricombinante.
- Dopo l'inserimento del gene esogeno nel vettore, il plasmide viene introdotto in Escherichia coli, dove si moltiplica rapidamente per produrre numerose copie del DNA ricombinante.
- La purificazione del DNA plasmidico avviene tramite lisi batterica, seguita dal recupero del gene esogeno tramite restrizione enzimatica ed elettroforesi su gel.
Indice
Inserimento del gene nel plasmide
Per inserire in un plasmide il gene che si vuole clonare, è necessario trattare il DNA plasmidico purificato con una endonucleasi di restrizione (la stessa utilizzata per ottenere dal DNA di origine il gene o frammento d’interesse). Il plasmide viene tagliato in un solo punto e le estremità libere vengono unite con quelle del gene esogeno, grazie all’azione di un enzima: la DNA ligasi.
Si forma così una molecola stabile di DNA ricombinante.
Funzione della DNA ligasi
Nelle cellule, la DNA ligasi è un enzima con la funzione di unire tra loro, durante la duplicazione del DNA, i frammenti di Okazaki. Viene ampiamente utilizzato nella tecnologia del DNA ricombinante, poiché consente al biologo di congiungere due frammenti qualsiasi di DNA mediante legami covalenti.
La DNA ligasi è in grado di unire in provetta anche DNA provenienti da organismi diversi, formando molecole che in natura non esistono. L’enzima DNA ligasi catalizza la congiunzione di due frammenti di DNA di qualsiasi origine, ricostruendo (con consumo di ATP) l’ossatura zucchero-fosfato tra i nucleotidi.
Moltiplicazione del DNA ricombinante
Dopo aver inserito il gene esogeno nel vettore, il plasmide viene introdotto per trasformazione in un batterio (generalmente Escherichia coli, ampiamente utilizzato in ingegneria genetica) e si fa crescere il batterio in un apposito terreno, dove si moltiplicherà molto rapidamente in modo da ottenere un elevato numero di copie del DNA ricombinante.
A ogni ciclo di divisione batterica raddoppia anche il numero di copie della molecola di DNA ricombinante. Dopo circa 24 ore si ottengono centinaia di milioni di copie del plasmide e quindi del gene. I batteri vengono in seguito lisati e viene purificato il DNA plasmidico. Le copie del gene esogeno vengono recuperate tagliando il plasmide con l’apposito enzima di restrizione e separando il gene mediante elettroforesi su gel.
Domande da interrogazione
- Come viene inserito un gene in un plasmide?
- Qual è la funzione della DNA ligasi nella tecnologia del DNA ricombinante?
- Come si moltiplica il DNA ricombinante dopo l'inserimento del gene esogeno?
Il gene viene inserito in un plasmide trattando il DNA plasmidico con un'endonucleasi di restrizione, tagliando il plasmide in un solo punto e unendo le estremità libere con quelle del gene esogeno tramite la DNA ligasi.
La DNA ligasi unisce frammenti di DNA mediante legami covalenti, permettendo di congiungere DNA provenienti da organismi diversi e formando molecole che non esistono in natura.
Il plasmide con il gene esogeno viene introdotto in un batterio, come Escherichia coli, che si moltiplica rapidamente, raddoppiando il numero di copie del DNA ricombinante a ogni divisione batterica.
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