Tecniche avanzate di manipolazione genetica e loro implicazioni

Comprendere il DNA

Al fine di comprendere un organismo o una cellula, è necessario studiarne il DNA, il quale si può modificare oggigiorno. Esso è una molecola che ha funzione d’informazione e non di struttura, in quando vi sono quattro parti che si ripetono all’infinito, che possono però determinare molto, identificare un gene è difficile, poiché non ha un sito preciso.

Tecniche di sequenziamento

Anche se sembra impossibile, le tecniche di sequenziamento del DNA sono in rapido sviluppo. Occorre quindi rompere la molecola in pezzi più piccoli, utilizzando ultrasuoni o metodi chimici. Tuttavia si preferisce usare gli enzimi di restrizione, che tagliano il DNA come forbici, denominate alfanumericamente in base al batterio dal quale sono state isolate. Ogni enzima sequenzia una determinata parte di genoma, costituita da quattro a otto paia di basi dette sito di restrizione. Così facendo si ottengono frammenti pressoché identici poiché ognuno è riconosciuto da un determinato enzima. I siti riconosciuti sono palindromici. Gli enzimi possono tagliare in modo netto o sfalsato, i frammenti ottenuti hanno delle estremità dette estremità coesive, che possono collegarsi ad altri frammenti complementari.

Elettroforesi e denaturazione

Come per le proteine, anche gli acidi nucleici possono essere sottoposti a elettroforesi, nel quale processo se si vogliono individuare frammenti di diversa lunghezza, essi vengono solubilizzati e messi in un gel di agarosio o poliacrilammide (che identifica anche un nucleotide di differenza) se non si superano le 500 bp, dopo l’applicazione di un campo elettrico ai capi della lastra. Tuttavia tutto risulta più semplice, poiché il DNA non va denaturato essendo sempre uguale la struttura e non va immerso nell’SDS avendo già una carica negativa data dai gruppi fosfato. Come localizzatore viene usato il bromuro di etidio, che emette luce dopo essere stato irradiato da luce ultravioletta.

Ibridazione e microarray

Il DNA è una molecola resistente, ma portandolo ad una temperatura di 100 gradi in un ambiente fortemente basico, la doppia elica si rompe, comportando la denaturazione del DNA, processo reversibile a 65 C°. Il processo è importante per localizzare un gene. Prima di tutto si separa il DNA con gli enzimi di restrizione, in seguito i frammenti vengono ordinati con l’elettroforesi e solo dopo, con la tecnica di blotting, i frammenti sono trasferiti su un foglio di nitrocellulosa, sul quale verranno messe delle sonde marcate composte da una sequenza complementare a quella cercata e essendo coperte di una sostanza fluorescente, quindi la temperatura viene abbassata cosicchè il DNA si appai con la sonda, poi vengono lavati via i frammenti non ibridati. I frammenti ottenuti potranno essere utilizzati in vario modo. Un altro tipo di ibridazione è quella in situ, ossia svolta direttamente sui cromosomi, oppure in un altro caso viene fatto ibridare l’mRNA per mettere in evidenza le cellule che esprimono particolari geni.

Le tecniche di microarray si basano sull’ibridazione genica, si tratta di un’analisi simultanea di numerosissimi geni. Per l’esecuzione di questa tecnica viene usato un array di sonde a DNA, un chip dalle dimensioni di un vetrino di microscopio che contiene migliaia di sonde complementari ai frammenti di DNA cercato, ogni sonda occupa un posto del chip detto spot. Un esempio di utilizzo dei microarray è la distinzione fra cellule normali e cellule tumorali, al fine di capire i geni attivi o disattivi nella cellula tumorale o espressi con diversa frequenza. Si parte prima dall’estrazione dell’mRNA, quindi si può ottenere un DNA complementare detto cDNA, i quali vengono marcati con diversi marcatori fluorescenti a seconda del tessuto dal quale sono stati prelevati, quindi vengono entrambi posti sul chip. In seguito i cDNA non ibridati vengono lavati via, quindi si passa a un analisi prima con un laser poi con un altro, le quali risposte delle cellule (che si illumineranno del colore del laser) determinano l’espressione o meno di un determinato gene in un determinato tessuto. Si può anche verificare che i due geni siano espressi sia in una cellula che nell’altra, saranno quindi caratterizzati da una mescolanza di colori. Inoltre, si può risalire al livello di espressione dei geni, osservando con quanta intensità vi sia la risposta da parte degli spot. I campi di applicazione sono vari: si può osservare come cambi il livello di espressione di un gene durante il ciclo cellulare, oppure si possono usare tutte le cellule di un organismo se se ne studia uno semplice (lievito di birra), o ancora si può notare quali geni si attivino o disattivino simultaneamente. Principalmente però, è importante la funzione di confronto fra due determinate cellule o organismi.

Clonaggio e librerie genomiche

Con il termine clonaggio (“clonazione” si usa per gli organismi, non per le cellule o macromolecole) si intende l’isolamento di un segmento di DNA per produrne tante copie identiche, esistono varie tecniche per farlo. Bisogna prima realizzare una libreria genomica o genoteca. Vanno quindi utilizzati dei vettori di clonazione (come ad esempio virus o plasmidi batterici), il termine “vettore” indica la capacità di portare informazioni in un altro organismo. Sono spesso usati i plasmidi batterici, ossia frammenti di DNA circolare presenti nel citoplasma di alcuni batteri. Sono usati in quanto hanno una dimensione di 10000 bp e non possono ospitare frammenti superiori alle loro dimensioni. Alcuni vettori derivano da plasmidi modificati o cromosomi di lievito modificati (YAC), che sono un centinaio di volte più grandi dei plasmidi normali, tutto dipende dalle dimensioni della quantità di DNA presa in esame. Per inserire il DNA dei vettori vengono usati degli enzimi di restrizione che producono un taglio sfalsato al plasmide che abbia le estremità complementari al frammento di DNA che si vuole clonare, spesso si usa lo stesso enzima per DNA e plasmide, così entrambi si appaiano spontaneamente. Viene quindi usato il DNA ligasi per formare legami covalenti stabili fra DNA e plasmide, si formeranno quindi dei plasmidi ricombinanti ibridi. Tramite tecniche specifiche, ad esempio con elettroshock o con uso di sostanze chimiche, il plasmide ibrido viene introdotto nel batterio, che poi sarà messo in coltura in laboratorio. Per selezionare i batteri che hanno il plasmide ricombinante da quelli che non lo hanno, si usa spesso la caratteristica debolezza agli antibiotici dei batteri (come ad esempio la debolezza all’ampicillina), mentre nei batteri con il plasmide modificato vi sarà resistenza, i batteri non “ibridati” saranno uccisi.

Per costruire i vettori ricombinanti si può partire da un genoma intero o da da una grossa porzione di DNA, le cellule trasformate possono essere poste a coltura e costituire una libreria genomica, poiché tutte le cellule con il vettore modificato conterranno tutto il DNA di partenza, ma per analizzare un singolo gene è necessaria un’operazione di screening del DNA (analisi) e di amplificazione. Al fine di isolare un gene o una sequenza: i batteri sono fatti crescere su un terreno liquido, poi trasferite in una piastra di Petri dopo essere state diluite, quindi verranno fatte crescere delle colonie, in seguito vengono usate tecniche di ibridazione per identificare la colonia che possiede il DNA cercato, e una volta identificata, si può prelevare e utilizzare o essere messa a coltura, in modo da avere in poco tempo miliardi di cellule utilizzabili.

In gran parte dei casi i ricercatori vogliono isolare librerie che contengano i geni espressi dalle cellule di un tessuto, prendono quindi come DNA l’mRNA. L’enzima trascrittasi inversa serve a ottenere DNA a singolo filamento complementare all’mRNA, legandosi a quest’ultimo e producendo il primo. Il DNA complementare (cDNA) all’mRNA può essere usato per ottenere librerie di cDNA, in modo più semplice rispetto a come si faceva per le librerie genomiche. Le informazioni che possono essere ricavate da una libreria di cDNA sono: le informazioni direttamente sui geni espressi trascritti in mRNA, si può quindi risalire alle proteine attive in un tessuto; non essendovi introni, sequenze di lunghezza variabile, poiché vengono eliminate dall’mRNA dopo la trascrizione, di conseguenza con il cDNA si dispone di una sequenza decodificabile immediatamente in una proteina, inoltre si può confrontare con il DNA genomico per identificare le sequenze introniche; le librerie di cDNA presentano geni integri, non vi sono produzioni di geni frammentati, poiché un frammento di cDNA corrisponde a un gene intero tradotto in mRNA; infine, la quantità di cDNA ottenuto determina l’intensità di espressione di un dato gene, poiché essa è direttamente proporzionale al numero di mRNA che contengono quel gene.

Screening: coltura, impressione su un disco di carta → batteri denaturati e uccisi → sonde marcate → lavaggio DNA non ibridato.

Sintesi cDNA: copia di mRNA con trascrittasi inversa → degradazione con RNasi → sintesi e unione con un complementare del cDNA con DNA polimerasi.

PCR e sequenziamento

La PCR, o reazione a catena polimerasi è una tecnica molto recente (risale agli anni ‘80) che ha il compito di amplificare il DNA partendo da una minima parte di macromolecola. Per utilizzare questa tecnica serve conoscere le sequenze che fiancheggiano il tratto da amplificare (TDA), in particolare è necessario conoscere 20 paia di basi a monte e a valle per procedere. Nella miscela di reazione sono inseriti TDA, desossiribonucleotidi trifosfati (dNTP) e dei frammenti di DNA complementari alle sequenze che fiancheggiano il gene, chiamate primer, essenziali per far cominciare la duplicazione alla DNA polimerasi, alla quale si lega utilizzando il TDA come stampo. La PCR utilizza una serie di macchinari automatizzati e si divide in cicli che si ripetono in cui la miscela viene scaldata e raffreddata: all’inizio viene scaldata, ottenendo DNA a singolo filamento dal DNA di partenza, quindi viene raffreddata a 60° per far appaiare primer e sequenze di DNA, comincia la sintesi dei nuovi filamenti; nel secondo ciclo vengono prodotti filamenti partiti dai primer di lunghezza più lunga della sequenza voluta, cosa che verrà risolta nelle fasi successive, infatti la miscela verrà di nuovo riscaldata a 90° facendo separare il risultato dell’allungamento dai DNA originali, permettendone l’utilizzo in un nuovo ulteriore ciclo come se fossero DNA a singolo filamento uguali a quelli di partenza; andando avanti i prodotti cresceranno esponenzialmente (della potenza di 2 per intenderci). In poco meno di trenta cicli vengono infatti prodotti miliardi di nuovi filamenti, in cui quelli di lunghezza anomala saranno minimi rispetto a quelli della lunghezza corretta. Per allungare i filamenti viene utilizzata una DNA polimerasi speciale detta Taq polimerasi, che deriva dal Thermus aquaticus, batterio acquatico appunto che riesce a sopravvivere a temperature molto alte (come quelle della polimerasi). Il processo è davvero molto utile, inoltre è anche possibile evitare di usare gli enzimi di restrizione mettendo dei primer dalla sequenza casuale ma di lunghezza opportuna, grazie alla PCR i lavori in laboratorio sono stati di molto accelerati. Fra le applicazioni della PCR si hanno l’analisi di campioni clinici per verificare la presenza di agenti infettivi, si potrebbe partire anche da una singola celluloa, inoltre ha applicazioni in criminologia

Con sequenziamento s’intende la determinazione di una sequenza di nucleotidi nel DNA, il che è un’operazione molto difficile considerando la grandezza dei genomi, anche se le tecniche sono in rapida evoluzione, le quali hanno ricevuto un impulso dal Progetto Genoma Umano, concluso nel 2003, che si è proposto di sequenziare l’intero genoma umano. Uno dei metodi efficaci per il sequenziamento consiste nell’utilizzo dei dideossinucleotidi trifosfati (ddNTP), detti anche terminatori di catena, ai quali manca un atomo di ossigeno sul carbonio 3’. Si procede come se si volesse ampliare il DNA, solo che nella miscela vengono introdotti questi terminatori di catena, che la DNA polimerasi non riconosce, di conseguenza vengono incorporate nella fase di allungamento ma a quel punto non si può proseguire, formando dei filamenti “interrotti”. Per determinare la lunghezza dei fari filamenti, all’inizio veniva usata l’autoradiografia, associata all’elettroforesi del DNA, oggi invece vengono utilizzati dei marcatori fluorescenti per ogni ddNTP: quando ogni frammento acquisisce un ddNTP vi è un processo di elettroforesi (che separa in base alla lunghezza delle molecole), il cui risultato si potrà leggere come la posizione di ogni nucleotide nel filamento di DNA.

Produzione di proteine e OGM

Oggigiorno è possibile produrre proteine conoscendo la sequenza genetica che lo codifica, prima venivano utilizzate grandi porzioni di tessuto, oggi sono usati dei vettori d’espressione, capaci di trasportare un particolare gene in un organismo ospite, essi possiedono dei promotori forti rispetto ai corrispettivi di clonazione, che portano a un’elevata espressione del gene studiato. Le proteine usate per questo scopo sono diverse a seconda del prodotto che si desidera, vi sono sistemi procariotici (Escherichia Coli) oppure eucariotici (lievito di birra), ma possono essere usate anche cellule animali in coltura. I sistemi procariotici sono più facili da usare e si riproducono in pochissimo tempo, ma spesso risultano incompatibili nella produzione di proteine umane, in quanto non presentano la fase post-traduzione eucariotica (non si formano correttamente dei ponti disolfuro). Tuttavia, i batteri sono stati utilizzati fin dagli anni ‘70 e hanno permesso l’isolamento facilitato dell’insulina dall’ E. Coli, mentre prima era necessario uccidere circa 70 maiali per produrre una riserva annua per un individuo. Come vettori di espressione nei batteri e nei lieviti sono usati i plasmidi, mentre nelle cellule animali o vegetali dei virus modificati. Questi devono presentare una sequenza, detta promotore, a cui si lega la RNA polimerasi avendo così un’alta trascrizione del gene inserito, ma viene inserito anche un marcatore per selezionare le cellule che hanno ricevuto il vettore. In alcuni casi vengono usati dei promotori inducibili, ossia che possono essere attivati se vengono cambiate le condizioni del sistema in cui si trovano, un esempio di utilizzo lo si ha nei batteri, che possono crescere prima che venga attivato il promotore, producendo la proteina voluta in grande quantità.

Quando si fa riferimento a organismi che hanno subito un’alterazione dei geni, si parla di OGM, dei quali si hanno notizie dagli anni ‘70 con l’E. Coli. Tuttavia esempi di OGM si possono trovare sin dall’antichità, quando l’uomo ha modificato con le tecniche di agricoltura il fenotipo delle piante selvatiche arrivando alle varietà domestiche. Oggi con l’ingegneria genetica si può eliminare qualsiasi problema legato al trasferimento massiccio di geni, con un lato negativo però, infatti alcuni geni funzionano soltanto in presenza di altri, ciò rende le antiche tecniche più efficienti. In questo caso si parla di pool genici. Gran parte della genetica moderna si basa sugli OGM, all’inizio si ebbero preoccupazioni poiché l’E. Coli rimane pure sempre un batterio, che può infettare gli umani, può scappare da un laboratorio e infettare l’ambiente date le dimensioni. A causa di questo nel 1975 fu tenuta una conferenza in California che stabilì 4 livelli di sicurezza a seconda degli organismi utilizzati, proibendo l’utilizzo di alcuni. Oggi l’utilizzo degli OGM è vastissimo, molti sono utilizzati in campo biomedico o industriale, aiutano per la produzione di antibiotici o vaccini, hanno anche finalità alimentari (yogurt) e addirittura alcuni hanno il compito di ridurre l’inquinamento ambientale.

Tecniche di modificazione genetica

Al fine di modificare il genoma delle piante esistono varie tecniche, le più diffuse utilizzano l’Agrobacterium tumefaciens, un organismo che provoca la crescita di “tumori” nelle piante. Esso utilizza un plasmide detto Plasmide Ti, grazie al quale inserisce i propri geni all’interno della pianta, formando una escrescenza detta galla del colletto, in cui il batterio prolifera. Circa 30 anni fa è stato possibile modificare il plasmide del batterio consentendo la produzione di organismi OGM. Questa è una dimostrazione del fatto che anche in natura esistono “scambi di geni” e la selezione naturale provvede non soltanto a far proseguire una specie, bensì vari tipi che sono stati infettati dal batterio. Attualmente le piante OGM sono utilizzatissime in campo biomedico, inoltre sono sistemi eucariotici e quindi più efficienti dei batteri per la produzione di proteine umane ad esempio. I vari tipi di piante OGM possono presentare: resistenza agli erbicidi, in agricoltura vi sono piante competitrici (infestanti) che ostacolano la crescita e l’assorbimento di nutrienti delle piante coltivate, a tal fine esistono gli erbicidi o diserbanti, che uccidono le piante infestanti, tuttavia, se si utilizzano diserbanti specifici, questi potrebbero non agire bene, mentre i più forti potrebbero danneggiare le piante coltivate, sono state quindi introdotte piante resistenti al glifosato, maggior componente dei diserbanti, anche se vi è un dibattito in corso sui possibili danni all’ecosistema e all’uomo, in quanto potrebbe essere una sostanza probabilmente cancerogena; resistenza all’attacco di insetti nocivi, molti insetti possono danneggiare i raccolti, quindi le piante sono state modificate in modo da avere la tossina Bt, del batterio Bacillus thuringiensis, che uccide o allontana gli insetti, essa non sembra avere effetti nocivi sull’uomo, almeno non a breve termine, un altro lato negativo è il favorire la crescita di insetti resistenti a questa tossina (come accadde per il DDT) oppure vi potrebbe essere una modifica all’ecosistema in quanto molti individui di una specie vengono eliminati, favorendo il proliferare di altre specie; resistenza ai virus, poiché i virus possono portare patologie alla pianta; crescita più rapida, di cui un esempio è l’eucalipto, al fine di produrre più legname combattendo la desertificazione; resistenza all’aridità, grazie alla quale le piante necessitano di una minore quantità d’acqua per sopravvivere, inserendo nelle piante geni tipici dei soggetti che sopravvivono in aree deserte, questo può aiutare la lotta alla desertificazione e al consumo eccessivo di acqua dolce; modificare la quantità di particolari sostanze, della quale è degli esempi sono il tabacco con meno nicotina ed il Golden Rice, quest’ultimo è un riso speciale con maggiori quantità di betacarotene (provitamina A), poiché nelle zone in cui viene consumato il riso vi è carenza della suddetta (VAD), in seguito a questo problema il prof. Potrykus produsse questo riso, anche se la sua produzione è stata ostacolata essendo comunque un organismo geneticamente modificato, ultimamente si sta utilizzando nel Sudest Asiatico e nelle Filippine; limitare la senescenza dei frutti, ossia la tendenza a marcire, viene aumentato il tempo di conservazione; facilitare la produzione di ibridi, Strampelli selezionò decine di semi di frumento altamente produttive, basandosi sulle tecniche di genetica classica, le incrociò selezionando i caratteri desiderati, al fine di produrre piante molto produttive, dato che questo fine sembrava impossibile per le piante italiane, cominciò a procurarsi piante provenienti da paesi stranieri. Riguardo quest’ultimo punto, quando vengono incrociate due linee pure, gli eterozigoti presentano una grande vitalità, ciò è detto vigore degli eterozigoti, ereditando entrambi i caratteri della generazione parentale. Per questo da tempo gli agricoltori usano semi ibridi più produttivi dei normali, che vanno ricomprati quando si ripete il raccolto, al posto di usare i semi prodotti da esso. Questo conviene per l’alta produttività dei semi. Per produrre semi ibridi è necessario che non si fecondino individui della stessa linea o gli individui stessi (autofecondazione), per questo grazie all’ingegneria genetica sono prodotti dei maschi sterili, che non producono polline. Per questo motivo se si tentano di incrociare due tipi di piante (ad esempio il mais) non vi è il rischio che vi sia stata autofecondazione. Tuttavia le piante non devono rimanere sterili, infatti il carattere della sterilità è recessivo e gli individui eterozigoti saranno quindi fertili, qualora invece fosse dominante, si può ricorrere sempre all’ingegneria genetica.

Controversie sugli OGM

Numerose organizzazioni private stanno conducendo una battaglia per bandire gli OGM, a causa della preoccupazione di gran parte della massa, anche se ne esistono così tanti tipi che sarebbe riduttivo generalizzare il problema, infatti nessuno scienziato è contrario alla manipolazione assoluta dei geni in un organismo, basti pensare all’insulina che salva milioni di malati di diabete. Uno dei motivi della lotta contro gli OGM riguarda la complessità degli organismi manipolati e il probabile fallimento della gestione degli esperimenti, inoltre come detto prima organismi come batteri possono diffondersi nell’ambiente e danneggiarlo o addirittura scambiarsi a vicenda il materiale genetico. Altri organismi, come il lievito di birra, non suscitano preoccupazioni. Ma soprattutto, lotta contro gli OGM significa anche lotta contro le multinazionali che ne gestiscono la commercializzazione, rischiando di danneggiare la biodiversità o addirittura vendendo prodotti non sufficientemente controllati. Tuttavia, vedendola da questo punto di vista, si stanno attaccando le multinazionali, che interferiscono già da anni con il mercato in generale, e non gli OGM. Inoltre se si considerano molti esperimenti riusciti con successo, come il Golden Rice, si pongono critiche specifiche agli OGM, non risulterebbe più una battaglia assoluta e tutto non avrebbe senso, motivo per il quale i movimenti criticano il Golden Rice nonostante gli intenti benefici. Un altro motivo che incute timore è la probabile contaminazione degli organismi selvatici da parte di quelli transgenici, tuttavia vanno fatte delle considerazioni: si stanno facendo esperimenti di questo genere da quasi mezzo secolo, nonostante siano fuggiti dai laboratori numerosissimi batteri, non è stato verificato alcun tipo di danno ecologico; prendendola inoltre da un punto di vista evolutivo, se si considera la selezione naturale, un organismo geneticamente modificato si estingue necessariamente se liberato in natura, in quanto i prodotti dell’uomo non sono adattati all’ambiente, in tal caso quindi, la natura non ne sarebbe lesa in alcun modo in quanto gli organismi OGM si estinguerebbero del tutto e rapidamente. Questi motivi dimostrano che vanno fatte considerazioni specifiche sugli OGM e sui geni studiati e non va ingaggiata una lotta assoluta.

Clonazione e cellule staminali

A differenza del clonaggio, la clonazione riguarda interi organismi. In natura esempi di clonazione li possiamo trovare nell’idra, e quindi nelle riproduzioni asessuate, ma anche nelle piante al fine di ottenere una determinata pianta (ci sono metodi naturali e artificiali), è il caso del banano. Ma per quel che riguarda gli animali le tecniche sono molto più complesse, a causa della riproduzione sessuata. Nel 1900 Hans Spemann riuscì a separare i blastomeri di tritone nelle prima fasi di sviluppo utilizzando un capello di suo figlio, costruendo un cappio da stringere attorno all’embrione. Così facendo si venivano a formare due cellule che crescevano l’una indipendentemente dall’altra, ottenendo due individui con lo stesso genoma, ma soltanto se si agiva nei primi stadi di sviluppo. Spemann per primo formulò l’ipotesi di estrarre il nucleo da una cellula e impiantarlo in un ovocita per ottenere la clonazione di un individuo adulto. I primi successi furono ottenuti da Gurdon, che riuscì a clonare l’anfibio Xenopus laevis, trasferendo il nucleo delle cellule differenziate intestinali in cellule uovo private del nucleo. Furono clonati anche mammiferi fin dagli anni ‘80 partendo da cellule embrionali, in cui queste ultime vengono isolate per poi essere separate dai loro nuclei, che saranno inseriti negli ovociti fecondati, il genotipo sarà uguale all’embrione ma non si conosce il fenotipo. Il primo mammifero clonato partendo dal nucleo di una cellula differenziata è stata la pecora Dolly, del gruppo di ricerca di Ian Wilmut. Gli scienziati prelevarono il nucleo da impiantare in una cellula uovo fecondata e privata del nucleo di un altro individuo da una ghiandola mammaria, per poi diventare embrione e essere impiantato in una madre adottiva. Dolly fu abbattuta dopo 7 anni a causa di un’infezione polmonare. Con lo stesso metodo sono stati clonati dei topi da laboratorio, utili per gli esperimenti poiché hanno un genoma simile a quello umano ed essendo clonati vi è meno variabilità ed errore nei risultati.

Con lo stesso metodo inoltre si possono produrre cellule staminali in coltura, prelevandole da un embrione clone di un essere umano adulto, riducendo il rischio di rigetto da parte dell’uomo (ovviamente tutto ciò è oggetto di problemi etici in quanto spesso si tratta di uccidere esseri viventi). Si parla addirittura di poter riportare in vita degli esseri viventi estinti, come il mammut partendo dall’elefante indiano (questo però potrebbe portare problemi all’ecosistema), anche se i tentativi al momento non hanno avuto molto successo.