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Come ottenere cDNA


I geni vengono inseriti nei vettori plasmidici, a loro volta introdotti in cellule; queste possono riprodursi in terreni di coltura. Le colonie possono riprodurre un determinato contenuto genetico che può essere depositato nei plasmidi. Il genoma umano può essere contenuto in diverse cellule batteriche. Il DNA umano ha però una caratteristica: contiene gli introni, che i plasmidi non sono in grado di esprimere. Anche se poi il batterio non li esprime, sono comunque molto utili per la ricerca.
Le colonie di batteri possono contenere DNA normali o cDNA. Può essere obbligatorio usare quest’ultimo perché l’mRNA è privo di introni e i batteri a quel punto possono anche esprimerlo. Se lo scopo del lavoro è quello di vedere come si esprimono determinati geni o produrre molecole il cui contenuto viene espresso da un mRNA, bisogna utilizzare un cDNA perché il batterio non è in grado di produrre una proteina da un’intera sequenza di DNA eucariotico. Farebbero una proteina con dentro gli introni.
La coda Poli-A è complementare con la timina. Frammenti di poli-T si legano agli mRNA maturi. Una volta che i mRNA maturi sono fissati alla resina, è possibile far uscire tutto ciò che non le si è fissato e staccare gli RNA messaggeri dalla resina e farli uscire. Li si può quindi isolare tramite le code. Gli mRNA maturi possono essere trascritti in cDNA tramite trascrittasi inversa; si ottiene una copia di DNA che viene amplificata dalla PCR o è fatta ospitare dai plasmidi.
Se è stato ottenuto il cDNA o si tratta di un DNA tagliato con enzimi di restrizione con anche gli introni, un altro problema è individuare quali geni sono presenti. Per farlo si usano sonde geniche, frammenti di DNA che viene marcato in genere con il P32, il fosforo radioattivo, un elemento chimico che emettendo radiazioni può impressionare una lastra fotografica. Una volta fatte crescere le colonie in una piastra Petri, vengono messe diverse colonie distanziate tra loro per non far entrare in contatto i batteri. A quel punto si utilizza una superficie di microcellulosa carica positivamente, che lega il DNA, che rimane sul filtro di microcellulosa, in cui viene disperso il materiale con la sonda genica. Essa è un segmento di DNA complementare a quello che si sta cercando. A quel punto la sonda genica si appaia alla sequenza complementare e diventa visibile da una lastra fotografica grazie al fosforo radioattivo. Sulla lastra si può vedere la posizione delle colonie che contengono il gene che si sta cercando. L’operazione può essere ripetuta con varie sonde geniche e si può identificare in ogni colonia quali segmenti di DNA sono stati prodotti. Bisogna far in modo ogni volta che il DNA sia denaturato, aperto, per fare in modo che la sonda genica gli si leghi.
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