Ibridazione e clonaggio di un gene

Ibridazione

La tecnica dell'ibridazione è utilizzata per verificare se un certo gene è presente in un campione di acido nucleico e/o per stabilire se un gene presenta mutazioni. Questa tecnica si basa sul fatto che un filamento di DNA si appaia a un altro (o a un filamento di RNA) soltanto se il secondo filamento ha una sequenza complementare alla sua.

Quindi una volta nota la sequenza del gene che si vuole individuare, è possibile preparare delle "sonde" da utilizzare allo scopo. Una "sonda" è un tratto di DNA a singolo filamento (formato da 10-1000 nucleotidi) sintetizzato in laboratorio dotandolo di una sequenza di nucleotidi complementare a quella del gene target e che viene marcata con coloranti fluorescenti o radioisotopi.

Le nuove tecniche di ibridazione utilizzano il microarray a DNA, una sorta di matrice in cui ogni elemento è un pozzetto che contiene molte copie di una sonda diversa di DNA a singolo filamento (probe); ciò consente di rilevare contemporaneamente l'espressione di più geni in diversi tessuti

L'anemia falciforme è una malattia genetica recessiva dovuta al cambiamento di un unico nucleotide: nella sequenza che codifica per la catena B dell'emoglobina, una tripletta CTC (GAG nell'mR-NA), che codifica per acido glutammico, è sostituita dalla tripletta CAC (GUG nell'mRNA), che codifica per valina. Per eseguire la diagnosi prenatale di tale malattia si estrae il DNA dalle cellule fetali (prelevate tramite amniocentesi) e lo si saggia con due sonde radioattive: una corrispondente alla sequenza genica normale e una corrispondente alla sequenza genica mutata. In questo modo è possibile stabilire se le cellule del feto contengono uno, due o nessun gene difettoso.

Clonaggio di un gene

Lo scambio di materiale genetico, che avviene anche in natura (basti pensare al crossing-over o al trasferimento genico nei batteri), in laboratorio si può ottenere inserendo il gene di un organismo nel DNA di un altro organismo, e creando così un DNA ricombinante. La metodica è nota come ingegneria genetica, o tecnologia del DNA ricombinante, ed è resa possibile dagli enzimi di restrizione: un frammento di DNA tagliato con un determinato enzima di restrizione può unirsi a un altro frammento di DNA tagliato con lo stesso enzima, perché i due hanno estremità adesive complementari. Le estremità adesive appaiate possono poi essere saldate stabilmente da un enzima detto DNA ligasi.

Nelle tecniche di ingegneria genetica, il DNA nel quale si inserisce il gene che codifica per una certa proteina è quello di un plasmide o di un batteriofago. Tale DNA ricombinante, grazie alla sua capacità di entrare in una cellula ospite e di replicarsi in essa, può agire da veicolo per il trasporto e la moltiplicazione del gene stesso. II DNA ricombinante contenente il gene che interessa viene quindi introdotto in un batterio o in un altro microrganismo in grado di moltiplicarsi velocemente, nel quale si comporta esattamente come il DNA originario: viene infatti sia duplicato al momento della riproduzione, sia trascritto, e l'mRNA corrispondente viene a sua volta normalmente tradotto.

Grazie alla rapida proliferazione batterica, da una singola cellula contenente il DNA ricombinante si può ricavare in breve tempo un numero enorme di cellule figlie geneticamente identiche (clone), anch'esse dotate del gene estraneo. I batteri contenuti il gene clonato possono produrre quindi la proteina a esso corrispondente, esattamente come se fosse una proteina propria. cTale proteina potrà poi essere recuperata dal terreno di coltura dei batteri, e purificata.

Con questa tecnica, i batteri funzionano dunque come "fabbriche in miniatura", in grado di produrre grandi quantità di proteine per noi utili e preziose, a costi inferiori rispetto a quelli di altre procedure.

La tecnologia del DNA ricombinante è possibile grazie all'universalità del codice genetico, che permette all'organismo ospite di leggere e tradurre, oltre al proprio DNA, anche quello di qualsiasi altro organismo.

Alcune applicazioni dell'ingegneria genetica

A pochi decenni dalla sua nascita, e con progressi continui, l'ingegneria genetica ha trovato un gran numero di applicazioni in molti ambiti. Elenchiamo di seguito alcuni tra i più rilevanti esempi:
- agricoltura e alimentazione:
- batteri che migliorano le caratteristiche del suolo;
- insetticidi naturali (per esempio: mais modificato con il DNA del Bacillus thurigiensis, che produce una tossina che uccide alcuni lepidotteri parassiti del mais);
- vegetali resistenti a stress idrico o salino;
- enzimi per l'industria alimentare (fermentazione della birra);
miglioramenti nutrizionali (Golden rice: riso addizionato di pro-vitamina A, consumato da popolazioni povere che hanno una dieta carente di vitamina A);
- medicina:
- farmaci (insulina, antibiotici, vaccini, interferone ecc.);
- modelli di ricerca per malattie genetiche;
- industria:
- bioplastiche;
- batteri che degradano inquinanti;
- produzione di fibre resistenti.

Organismi transgenici

Gli organismi transgenici sono organismi in cui sono stati incorporati geni estranei, provenienti da organismi diversi. Per introdurre i geni estranei possono essere utilizzati vettori come i virus, ma è anche possibile iniettare direttamente il DNA.

Per generare invece un animale transgenico, il DNA del gene che interessa viene iniettato in una cellula uovo, che poi verrà impiantata nell'utero di una femmina, oppure può essere iniettato in una cellula staminale embrionale, che viene poi inserita in una blastocisti (uno stadio precoce dello sviluppo embrionale) successivamente impiantata nell'utero di una femmina.

Genome editing

Il gene (o genome) editing è una particolare tecnica di ingegneria genetica grazie alla quale è possibile eliminare o sostituire un preciso gene in un organismo.

La tecnica del genome editing utilizza delle "forbici molecolari", come CRISPR/Cas9, un sistema di difesa dei batteri: l'acronimo CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) indica sequenze di DNA ripetute che sono presenti nel DNA dei batteri e che sono complementari a frammenti di DNA di batteriofagi che gli stessi batteri hanno incontrato precedentemente, mentre Cas9 (CRISP-asoociated protein 9) è un'endonucleasi, ossia una proteina in grado di tagliare il DNA.

Quando un batterio viene infettato da un batteriofago che ha nel DNA una sequenza già nota al batterio stesso, il genoma viene riconosciuto e distrutto, difendendo il batterio dall'infezione: la sequenza CRISPR "guida" Cas9 verso il genoma complementare e Cas9 lo taglia. Grazie a questo processo è possibile stabilire a priori la sequenza di DNA da tagliare, creando un CRISPR adeguato, che guidi Cas9 verso il gene da tagliare (e quindi silenziare, per esempio geni implicati nei tumori) o sostituire (per esempio geni implicati in malattie).