Tecniche di purificazione e amplificazione del DNA: clonaggio e PCR

Purificazione del DNA

La purificazione è necessaria per andare ad amplificare (ad esempio tramite PCR) solo il DNA del soggetto in questione. Per effettuarla si utilizzano specifici kit, che operano in due fasi:

1. Diluire la soluzione con un Eluition Buffer;

2. Centrifugare per far scendere il DNA in una provetta, in modo che tutte le impurità vengano trattenute da apposite membrane.

Metodi di amplificazione del DNA

L'amplificazione del DNA comprende due metodi: 1-Clonaggio; 2-PCR

1-Il clonaggio si attua introducendo del DNA estraneo in cellule di microrganismi, i quali, replicandosi, generano copie di DNA esogeno (dei cloni identici). In biologia molecolare clonare un tratto di DNA significa ottenere una popolazione di DNA identica a quella di partenza. Le fasi del clonaggio sono:

1. Estrazione del frammento del DNA e sua inserzione nel vettoresi forma la molecola ibrida, detta di DNA ricombinante.

2. Il vettore trasporta il DNA in una cellula ospite.

3. Il vettore si moltiplica, e per mitosi viene trasmesso alle cellule figlie. Si formano quindi copie identiche di DNA, i cloni.

4. Si ottiene una colonia di cellule ospiti contenenti molti cloni che possono essere estratti e studiati.

Strumenti per il clonaggio

Abbiamo visto che gli strumenti per il clonaggio sono due:

1) DNA ricombinante (Enzimi di restrizione e DNA ligasi).Gli enzimi, o endonucleasi, di restrizione sono enzimi (proteine attivate dal punto di vista chimico) in grado di riconoscere e tagliare il DNA in siti specifici, detti appunto siti di restrizione. La reazione di taglio è anche detta digestione, in quanto il DNA viene ridotto in siti più piccoli. Il taglio tuttavia avviene solo in determinate condizioni, cioè se il DNA non è metilato (non presenta un gruppo metile), e riguarda la rottura dei legami fosfodiesterici. Gli enzimi di restrizione sono di origine batterica, e difendono i batteri dal DNA esogeno. Per far si che l’endonucleasi non tagli il DNA del batterio sono presenti delle metilasi che posizionano un gruppo metile sul DNA.

Le endonucleasi tagliano il DNA in due modi: alla stessa altezza, creando estremità nette (o spuntate), oppure ad altezze diverse, creando estremità protrudenti (o appiccicose)

Le estremità che vengono tagliate dallo stesso enzima sono complementari, in quanto l’enzima taglia sempre nello stesso sito. Queste estremità possono essere saldate tra loro (le protrudenti si saldano meglio rispetto alle nette) attraverso l’enzima DNA-ligasi.

2) Cellule ospiti: vettori molecolari (Vettori di espressioni, Plasmidi, Batteriofagi es. virus)

2-PCR (Polymerase chain reaction). Inventata nel 1983 da Kary Mullis inizia ad essere ampliamente utilizzata negli anni ’90. È un metodo che sfrutta la conoscenza di parte della sequenza del filamento d’interesse per ottenerne un numero indefinito di copie. La PCR utilizza il filamento prodotto durante un ciclo come stampo per il ciclo successivo (andamento esponenziale). È un metodo che viene utilizzato in caso di scarsità di materiale. Trova moltissimi impieghi in ambito medico e legale, in quanto permette di duplicare regioni ben definite del DNA in poche ore e utilizza l’enzima polimerasi, che è naturalmente responsabile della duplicazione genica.

PreparazioneIn una provetta vengono messi:

-Il filamento di DNA da clonare;

-I primer forward e reverse, cioè sequenze artificiali che determinano l’innesco;

-L’enzima Taq polimerasi (derivante dal Thermus acquaticus, un batterio particolarmente resistente alla temperatura);

-Vari nucleotidi liberi (A, T, C, G);

-Buffer, che mantiene il pH a livelli stabili e costituisce l’ambiente necessario alla reazione.

Fasi

a. Denaturazione, il miscuglio viene riscaldato fino a 94°C e i filamenti di DNA si separano;

b. Appaiamento dei primers, in cui la temperatura viene abbassata tra i 37°C e i 60°C, permettendo ai due primers di appaiarsi (se la T non è giusta i primers NON funzionano);

c. Sintesi, la temperatura viene portata a 72°C e l’enzima polimerasi copia i filamenti di DNA;

d. La temperatura viene riportata a 94°C per separare i doppi filamenti formatisi e ricominciare il ciclo.

Si compiono in media dai 25 ai 40 cicli, grazie a un’apposita macchina, il termociclatore.