Metodi avanzati di clonaggio e amplificazione del DNA: clonaggio e PCR

Comprende due metodi: 1-Clonaggio; 2-PCR

1-Il clonaggio si attua introducendo del DNA estraneo in cellule di microrganismi, i quali, replicandosi, generano copie di DNA esogeno (dei cloni identici). In biologia molecolare clonare un tratto di DNA significa ottenere una popolazione di DNA identica a quella di partenza.

Fasi del clonaggio

Le fasi del clonaggio sono:

1. Estrazione del frammento del DNA e sua inserzione nel vettore: si forma la molecola ibrida, detta di DNA ricombinante.

2. Il vettore trasporta il DNA in una cellula ospite.

3. Il vettore si moltiplica, e per mitosi viene trasmesso alle cellule figlie.

4. Si ottiene una colonia di cellule ospiti contenenti molti cloni che possono essere estratti e studiati.

Strumenti per il clonaggio

Abbiamo visto che gli strumenti per il clonaggio sono due:

1) DNA ricombinante (Enzimi di restrizione e DNA ligasi)

2) Cellule ospiti: vettori molecolari (Vettori di espressioni, Plasmidi, Batteriofagi es. virus)

1)Gli enzimi, o endonucleasi, di restrizione sono enzimi (proteine attivate dal punto di vista chimico) in grado di riconoscere e tagliare il DNA in siti specifici, detti appunto siti di restrizione. La reazione di taglio è anche detta digestione, in quanto il DNA viene ridotto in siti più piccoli. Il taglio tuttavia avviene solo in determinate condizioni, cioè se il DNA non è metilato (non presenta un gruppo metile), e riguarda la rottura dei legami fosfodiesterici. Gli enzimi di restrizione sono di origine batterica, e difendono i batteri dal DNA esogeno. Per far si che l’endonucleasi non tagli il DNA del batterio sono presenti delle metilasi che posizionano un gruppo metile sul DNA.

Le endonucleasi tagliano il DNA in due modi: alla stessa altezza, creando estremità nette (o spuntate), oppure ad altezze diverse, creando estremità protrudenti (o appiccicose)

Le estremità che vengono tagliate dallo stesso enzima sono complementari, in quanto l’enzima taglia sempre nello stesso sito. Queste estremità possono essere saldate tra loro (le protrudenti si saldano meglio rispetto alle nette) attraverso l’enzima ligasi.

Gli enzimi di restrizione riconoscono siti specifici che vanno da 4 a 8 basi (più è lunga meno è frequente).

Caratteristiche delle endonucleasi

Le endonucleasi hanno inoltre alcune particolarità:

o Ne sono stati isolati oltre 3500, ma le sequenze che possono essere tagliate sono circa 200: quindi sono isoschizomeri, cioè enzimi provenienti da batteri diversi che hanno la stessa specificità di sequenza.

o Tagliano sequenze palindromiche, che possono essere lette in ugual modo da destra e da sinistra. (Endonucleasi tipo II)

I vari frammenti di DNA generati possono essere separati su elettroforesi in gel di agarosio, una tecnica che sfrutta la diversa lunghezza, e quindi il diverso peso, e di conseguenza diversa velocità di scorrimento dei frammenti di DNA ottenuti. Colorando il gel si generano una serie di bande, ognuna delle quali contiene un frammento di restrizione il cui peso molecolare può essere stabilito confrontandolo con DNA standard. Con questa tecnica è possibile effettuare la mappatura enzimatica di un sito di DNA.

Vettori molecolari e plasmidi

2)Vettori molecolari

2A) Plasmidi: I plasmidi sono molecole di DNA circolari presenti in molti batteri. Vengono utilizzati perché di piccole dimensioni, perché sono presenti in molte copie per cellula e perché posseggono un’origine di replicazione (sono quindi replicati autonomamente rispetto al cromosoma). Inoltre spesso presentano geni di un vantaggio selettivo, come la resistenza agli antibiotici, che rendono facile riconoscere le cellule che li contengono. A partire dagli anni ’70 vengono creati i primi plasmidi sulla base di quelli già esistenti in natura, oggi ne esistono alcuni totalmente artificiali.

Utilizzo dei plasmidi

Nei plasmidi vengono messi dei marcatori (motivo di grande polemica a partire dagli anni ’80), come geni per la resistenza agli antibiotici (oggi si utilizzano geni per la luciferasi), che permettono di selezionare solo quei batteri che recepiscono il plasmide. In particolare il batterio assorbe il plasmide quando è nello stato di “competenza”, poi per scissioni il batterio si replica quindi moltiplica anche il plasmide al suo interno.

Altre sequenze aggiunte in fabbrica all’interno del plasmide sono specifiche per un enzima di restrizione, è quindi possibile aprire in laboratorio un plasmide per inserirvi un gene estraneo, a sua volta tagliato con lo stesso enzima di restrizione. Inoltre vi sono alcuni siti per enzimi di restrizione diversi da quelli usati per l’inserzione del gene, che tagliano in siti vicini (a monte e a valle) del gene inserito, quindi non direttamente sul gene.

I plasmidi all’interno della cellula sono presenti nella forma super avvolta, in quanto hanno comunque una modesta lunghezza e devono stare nella cellula batterica.

Attraverso l’utilizzo degli enzimi di restrizione è possibile effettuare la mappatura enzimatica del DNA, cioè stabilire dove si trovano i siti di restrizione su quel pezzo di DNA.

Polymerase chain reaction (PCR)

2-PCR (Polymerase chain reaction). Inventata nel 1983 da Kary Mullis inizia ad essere ampliamente utilizzata negli anni ’90. È un metodo che sfrutta la conoscenza di parte della sequenza del filamento d’interesse per ottenerne un numero indefinito di copie. La PCR utilizza il filamento prodotto durante un ciclo come stampo per il ciclo successivo (andamento esponenziale). È un metodo che viene utilizzato in caso di scarsità di materiale. Trova moltissimi impieghi in ambito medico e legale, in quanto permette di duplicare regioni ben definite del DNA in poche ore e utilizza l’enzima polimerasi, che è naturalmente responsabile della duplicazione genica.

Preparazione della PCR

PreparazioneIn una provetta vengono messi:

-Il filamento di DNA da clonare;

-I primer forward e reverse, cioè sequenze artificiali che determinano l’innesco;

-L’enzima Taq polimerasi (derivante dal Thermus acquaticus, un batterio particolarmente resistente alla temperatura);

-Vari nucleotidi liberi (A, T, C, G);

-Buffer, che mantiene il pH a livelli stabili e costituisce l’ambiente necessario alla reazione.

Fasi della PCR

Fasi

a. Denaturazione, il miscuglio viene riscaldato fino a 94°C e i filamenti di DNA si separano;

b. Appaiamento dei primers, in cui la temperatura viene abbassata tra i 37°C e i 60°C, permettendo ai due primers di appaiarsi (se la T non è giusta i primers NON funzionano);

c. Sintesi, la temperatura viene portata a 72°C e l’enzima polimerasi copia i filamenti di DNA;

d. La temperatura viene riportata a 94°C per separare i doppi filamenti formatisi e ricominciare il ciclo.

Si compiono in media dai 25 ai 40 cicli, grazie a un’apposita macchina, il termociclatore.