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Endonucleasi e ligasi


Alla base dunque delle metodologie che producono e moltiplicano una molecola di DNA ricombinante vi sono due enzimi: le endonucleasi o enzimi di restrizione, molecole note sin dagli anni ‘60 nei batteri, che tagliano il DNA in corrispondenza di specifiche sequenze in frammenti di piccole dimensioni; la DNA ligasi, che unisce uno dei frammenti di DNA a un vettore (plasmide).
Il vettore ricombinante viene trasferito a una cellula batterica ospite, che si divide ripetutamente formando migliaia o milioni di cellule geneticamente identiche, che nell’insieme costituiscono un clone batterico; ciascun batterio reca lo stesso segmento di DNA estraneo e in questo metodo si effettua anche la donazione del DNA ricombinante.
Un clone può consistere anche in una progenie geneticamente identica, ottenuta a partire da un singolo individuo parentale.
Con queste metodologie in alcuni casi si ottengono molte copie dei geni desiderati, in altri le cellule batteriche ospiti del DNA ricombinante producono notevoli quantità di proteine codificate dal gene in esame.

Alcune fasi della tecnologia del DNA ricombinante sono:
(1) Rimozione di un frammento del DNA recante il gene prescelto da una cellula ed estrazione di un plasmide da un batterio;
(2) digestione del plasmide e del DNA in esame con lo stesso enzima dl restrizione; (3) inserimento del DNA, con il gene desiderato, nel plasmide;
(4) saldatura delle estremità coesive del plasmide e del DNA in esame, mediante DNA ligasi;
(5) si è ottenuta una molecola di DNA ricombinante circolare
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