Ali Q
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Concetti Chiave

  • La tecnologia del DNA ricombinante consente di modificare, ricombinare e inserire segmenti di DNA in cellule per studiare l'espressione genica.
  • Gli enzimi di restrizione, che tagliano molecole di DNA in segmenti, sono essenziali per identificare e manipolare sequenze specifiche.
  • Oltre 200 enzimi di restrizione sono isolati, permettendo il taglio del DNA presso diverse sequenze di riconoscimento per l'analisi e la sintesi in laboratorio.
  • La determinazione delle sequenze nucleotidiche si avvale di tecniche come elettroforesi e clonazione, consentendo la ricostruzione delle informazioni del DNA.
  • L'ibridazione dell'acido nucleico è utilizzata per localizzare segmenti specifici di DNA, sfruttando l'appaiamento delle basi azotate e l'uso di sonde marcate.

Indice

  1. Scoperte genetiche recenti
  2. Ruolo degli enzimi di restrizione
  3. Processo di ricucitura del DNA
  4. Isolamento e utilizzo degli enzimi
  5. Determinazione della sequenza nucleotidica
  6. Tecnica dell'ibridazione dell'acido nucleico

Scoperte genetiche recenti

Negli ultimi anni sono state fatte nuove scoperte che hanno rivoluzionato le nostre conoscenze sulla genetica di piante e animali, ma soprattutto sulle MALATTIE GENETICHE UMANE.
Tutto ciò è reso possibile dalla tecnica del DNA-RICOMBINANTE (di cui si occupa l’ingegneria genetica), in cui piccoli segmenti di DNA, prelevati da fonti diverse, vengono modificati, ricombinati, ed inseriti in altre cellule dove avviene l’espressione dei geni portati dal DNA modificato.

Per poter condurre questi studi occorre:

1) Avere piccoli segmenti di DNA da manipolare (e anche in grandi quantità);

2) Conoscerne la sequenza nucleotidica;

3) Essere in grado di identificare i segmenti specifici presi in considerazione.

Ruolo degli enzimi di restrizione

Si è scoperto che i virus che infettano un ceppo di E.Coli talvolta non sono capaci di infettarne un altro. Questo perché nei batteri sono presenti enzimi che tagliano le molecole estranee di DNA in piccoli segmenti prima che vengano duplicati o trascritti. Sono detti ENZIMI DI RESTRIZIONE.

I piccoli segmenti che gli enzimi hanno “riconosciuto” come estranei sono detti SEQUENZE DI RICONOSCIMENTO.

I nucleotidi di tali sequenze vengono quindi modificati chimicamente per non essere infettati.

Processo di ricucitura del DNA

Spesso i tagli operati dagli enzimi non sono netti, ma tali per cui resta una breve sequenza di nucleotidi spaiati su ciascuna estremità di taglio. Questo fa sì che esse siano “appiccicose” e possano riattaccarsi tra loro quando si formano spontaneamente dei legami a idrogeno con basi complementari. Il processo di ricucitura è completato dall’enzima DNA-LIGASI.

Il fatto importante è però che le estremità appiccicose possano unirsi con altri segmenti di DNA tagliati dallo stesso enzima che mostrano estremità complementari.

Isolamento e utilizzo degli enzimi

Attualmente sono stati isolati da differenti batteri più di 200 diversi enzimi di restrizione, e ciò permette di tagliare una molecola di DNA presso una qualsiasi delle sequenze di riconoscimento.

Questo permette di analizzare e manipolare le molecole di DNA.

In molti casi, se le sequenze nucleotidiche dei brevi tratti ottenuti sono note, si possono sintetizzare in laboratorio brevi segmenti di DNA con mezzi chimici.

E’ importante ricordare che enzimi differenti tagliano le molecole di DNA in siti differenti. Quindi la rottura di una molecola di DNA con un certo enzima di restrizione produce certi particolari segmenti.

Determinazione della sequenza nucleotidica

Di questi tratti è possibile determinare l’esatta sequenza nucleotidica tramite tecniche che prevedono elettroforesi, clonazione e sistemi computerizzati mel merito dei quali non entriamo.

Poichè i gruppi di frammenti prodotti dai diversi enzimi di restrizione si sovrappongono tra loro come un puzzle, una volta nota la sequenza nucleotidica dei singoli frammenti è possibile ricostruire le informazioni di un’intera molecola di DNA.

Tecnica dell'ibridazione dell'acido nucleico

Localizzare uno specifico segmento di un certo DNA è una questione complessa.

La tecnica utilizzata è quella dell’IBRIDAZIONE DELL’ACIDO NUCLEICO. Essa si basa sul fatto che le basi azotate degli acidi nucleici tendono ad appaiarsi.

Quando si fanno scaldare le molecole di DNA, i legami a idrogeno che tengono uniti i due filamenti si spezzano, e i filamenti si separano. Quando la soluzione viene raffreddata, i legami si riformano, e la struttura a doppia elica del DNA si ricostituisce.

Se si mescolano molecole di DNA provenienti da fonti diverse e le si scaldano, una volta raffreddata la soluzione, i filamenti di DNA differenti ma con sequenze quasi complementari si riappaiano tra loro formando una doppia elica ibrida.

La quantità in cui i segmenti dei due campioni si riassociano e la velocità con cui ciò avviene sono proporzionali alle somiglianze tra le sequenza nucleotidiche.

Si può a questo punto preparare una sonda incorporando un isotopo radioattivo in un breve segmento di DNA o RNA a filamento singolo complementare alla sequenza nucleotidica cercata, oppure marcandolo con un colorante fluorescente.

Domande da interrogazione

  1. Qual è il ruolo degli enzimi di restrizione nella tecnologia del DNA ricombinante?
  2. Gli enzimi di restrizione tagliano le molecole di DNA in piccoli segmenti, riconoscendo le sequenze estranee e permettendo la manipolazione e l'analisi del DNA.

  3. Come si ottengono i segmenti di DNA necessari per la manipolazione genetica?
  4. I segmenti di DNA si ottengono utilizzando enzimi di restrizione che tagliano il DNA in siti specifici, creando segmenti che possono essere ulteriormente modificati e ricombinati.

  5. In che modo si determinano le sequenze nucleotidiche dei segmenti di DNA?
  6. Le sequenze nucleotidiche si determinano tramite tecniche come l'elettroforesi, la clonazione e l'uso di sistemi computerizzati, che permettono di ricostruire l'intera molecola di DNA.

  7. Cos'è l'ibridazione dell'acido nucleico e come viene utilizzata?
  8. L'ibridazione dell'acido nucleico è una tecnica che sfrutta l'appaiamento delle basi azotate per localizzare segmenti specifici di DNA, utilizzando sonde marcate con isotopi radioattivi o coloranti fluorescenti.

  9. Qual è l'importanza delle estremità "appiccicose" nei segmenti di DNA tagliati?
  10. Le estremità "appiccicose" permettono ai segmenti di DNA di riattaccarsi tra loro, facilitando la ricombinazione con altri segmenti tagliati dallo stesso enzima e mostrando estremità complementari.

Domande e risposte

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