di La tecnologia del DNA ricombinante
Negli ultimi anni sono state fatte nuove scoperte che hanno rivoluzionato le nostre conoscenze sulla genetica di piante e animali, ma soprattutto sulle MALATTIE GENETICHE UMANE.
Tutto ciò è reso possibile dalla tecnica del DNA-RICOMBINANTE (di cui si occupa l’ingegneria genetica), in cui piccoli segmenti di DNA, prelevati da fonti diverse, vengono modificati, ricombinati, ed inseriti in altre cellule dove avviene l’espressione dei geni portati dal DNA modificato.
Per poter condurre questi studi occorre:
1) Avere piccoli segmenti di DNA da manipolare (e anche in grandi quantità);
2) Conoscerne la sequenza nucleotidica;
3) Essere in grado di identificare i segmenti specifici presi in considerazione.
Come ottenere i segmenti di DNA
Si è scoperto che i virus che infettano un ceppo di E.Coli talvolta non sono capaci di infettarne un altro. Questo perché nei batteri sono presenti enzimi che tagliano le molecole estranee di DNA in piccoli segmenti prima che vengano duplicati o trascritti. Sono detti ENZIMI DI RESTRIZIONE.
I piccoli segmenti che gli enzimi hanno “riconosciuto” come estranei sono detti SEQUENZE DI RICONOSCIMENTO.
I nucleotidi di tali sequenze vengono quindi modificati chimicamente per non essere infettati.
Spesso i tagli operati dagli enzimi non sono netti, ma tali per cui resta una breve sequenza di nucleotidi spaiati su ciascuna estremità di taglio. Questo fa sì che esse siano “appiccicose” e possano riattaccarsi tra loro quando si formano spontaneamente dei legami a idrogeno con basi complementari. Il processo di ricucitura è completato dall’enzima DNA-LIGASI.
Il fatto importante è però che le estremità appiccicose possano unirsi con altri segmenti di DNA tagliati dallo stesso enzima che mostrano estremità complementari.
Attualmente sono stati isolati da differenti batteri più di 200 diversi enzimi di restrizione, e ciò permette di tagliare una molecola di DNA presso una qualsiasi delle sequenze di riconoscimento.
Questo permette di analizzare e manipolare le molecole di DNA.
In molti casi, se le sequenze nucleotidiche dei brevi tratti ottenuti sono note, si possono sintetizzare in laboratorio brevi segmenti di DNA con mezzi chimici.
Come determinare le sequenze nucleotidiche:
E’ importante ricordare che enzimi differenti tagliano le molecole di DNA in siti differenti. Quindi la rottura di una molecola di DNA con un certo enzima di restrizione produce certi particolari segmenti.
Di questi tratti è possibile determinare l’esatta sequenza nucleotidica tramite tecniche che prevedono elettroforesi, clonazione e sistemi computerizzati mel merito dei quali non entriamo.
Poichè i gruppi di frammenti prodotti dai diversi enzimi di restrizione si sovrappongono tra loro come un puzzle, una volta nota la sequenza nucleotidica dei singoli frammenti è possibile ricostruire le informazioni di un’intera molecola di DNA.
Come localizzare segmenti specifici di DNA
Localizzare uno specifico segmento di un certo DNA è una questione complessa.
La tecnica utilizzata è quella dell’IBRIDAZIONE DELL’ACIDO NUCLEICO. Essa si basa sul fatto che le basi azotate degli acidi nucleici tendono ad appaiarsi.
Quando si fanno scaldare le molecole di DNA, i legami a idrogeno che tengono uniti i due filamenti si spezzano, e i filamenti si separano. Quando la soluzione viene raffreddata, i legami si riformano, e la struttura a doppia elica del DNA si ricostituisce.
Se si mescolano molecole di DNA provenienti da fonti diverse e le si scaldano, una volta raffreddata la soluzione, i filamenti di DNA differenti ma con sequenze quasi complementari si riappaiano tra loro formando una doppia elica ibrida.
La quantità in cui i segmenti dei due campioni si riassociano e la velocità con cui ciò avviene sono proporzionali alle somiglianze tra le sequenza nucleotidiche.
Si può a questo punto preparare una sonda incorporando un isotopo radioattivo in un breve segmento di DNA o RNA a filamento singolo complementare alla sequenza nucleotidica cercata, oppure marcandolo con un colorante fluorescente.
