Concetti Chiave
- La produzione di embrioni somatici inizia con la coltura di calli in vitro, partendo da espianti trattati con citochine e auxine per formare calli embriogenetici.
- La carota è un modello di studio per l'embriogenesi somatica, dove si usano frammenti di ipocotili per ottenere calli con alto potenziale embriogenico.
- L'embriogenesi somatica è osservata in piante come la Stella di Natale, Sweet Orange e Coffea arabica, mentre negli animali si nota nei sistemi di rigenerazione.
- La trasformazione genetica delle piante è spesso mediata da Agrobacterium tumefaciens, che introduce geni per auxine, citochinine e opine utilizzate come nutrimento.
- Il megaplasmide Ti induce tumori nelle piante, trasferendo T-DNA con geni specifici attraverso un processo regolato da proteine virali.
Indice
Coltura di calli in vitro
Bisogna stabilire una coltura di calli in vitro. Bisogna partire da un espianto, exiderlo e trasferirlo in vitro e indurre la comparsa dei calli in base citochina e auxina.
La carota è uno studio modello per l’embriogenesi somatica. Si prende un espianto, con i germogli ottenuti si prendono le estremità. Dalle porzioni di ipocotili si formerà del callo. Questi sono calli embriogenesi (forte potenziale a creare embrioni somatici).
Selezione e conteggio delle PEM
1. si ottiene una linea di cellule di callo in sospensione partendo da piccoli frammenti di ipocotile excisi da piantule germinate in vitro da semi sterilizzati.
2. si seleziona una sottopopolazione embriogenetica: masse pro-embriogeniche (masse pro embriogeniche) che si distinguono perché hanno una dimensione diversa. Mediante filtrazione, si fa una selezione in base alla dimensione. Si effettua un conteggio per sapere la concentrazione dei PEM, il conteggio viene effettuato al microscopio ottico.
Rimozione del fitormone auxina
3. si rimuove il fitormone auxina dal mezzo di coltura altrimenti non si avrà lo sviluppo di embrioni somatici.
4. si effettua il conteggio e si diluisce la popolazione di PEMs nel terreno di coltura. Non si scende al di sotto di una certa densità perché altrimenti le cellule muoiono. La giusta densità produce nel liquido dei segnali che vengono percepiti nelle cellule vicine che a loro volta rendono più potente e intensa l’attività di proliferazione e crescita.
Potenziale embriogenico delle colture
Il potenziale embriogenico di una coltura di cellule vegetali è elevato quando la coltura è giovane (
-Stella di natale (Euphorbia pulcherrima)
-Sweet orange (Citrus sinensis)
-
Rigenerazione nelle cellule animali
Come si comportano le cellule animali? Negli animali ci sono degli esempi di sistema di rigenerazione ad esempio negli arti degli anfibi oppure negli invertebrati. Per rigenerare si passa attraverso uno step intermedio di blastema.
Per poter produrre una pianta geneticamente modificata si vede avere un buon protocollo in vitro.
Trasformazione genetica mediata da Agrobacterium tumefaciens.
Per es ha tumore formato dalle cellule altamente specializzate, cellule producono grosse quantità di opine che sono forme modificate di aminoacidi, ricchi in C e N utilizzato dall’agrobacterium come nutrimento. Il T-DNA contiene non solo geni che consentono sintesi di auxine citochinine ma porta anche i geni che codificano per la sintesi di opine (octopina, mannopina). Un ceppo di A.T con mannopina avrà geni che serviranno per la sintesi solo per la mannopina, questa secreta dal tumore nel suolo potrà essere utilizzata solo da questo ceppo.
Funzione del T-DNA
T-DNA= abbiamo regioni terminali, che sono corte sequenze ripetute che sono riconosciute da endonucleasi di tipo vir che sono prodotte e accumulate nel momento in cui parte il processo di infezione. Le endonucleasi vir riconoscono e legano in maniera specifica le regioni Lb e Rb, tagliano e si excide un singolo filamento. Rb andrà a dirigere il T DNA. Il filamento singolo di DNA verrà ricoperto da proteine di tipo vir codificate da questo locus. Viaggia attraverso il canale proteico costituito da proteine vir di tipo b. Nel T-DNA abbiamo gene che codifica per le auxine e le citochinine.
Domande da interrogazione
- Come si producono gli embrioni somatici?
- Quali sono alcuni esempi di embriogenesi somatica?
- Quali tecniche di gene transfer sono utilizzate per produrre piante geneticamente modificate?
- Cos'è il megaplasmide Ti e quale ruolo svolge nel processo di infezione?
- Come si comportano le cellule animali in termini di rigenerazione?
Gli embrioni somatici si producono stabilendo una coltura di calli in vitro, partendo da un espianto e inducendo la formazione di calli con citochina e auxina. È essenziale rimuovere l'auxina per permettere lo sviluppo degli embrioni somatici.
Alcuni esempi di embriogenesi somatica includono la stella di Natale (Euphorbia pulcherrima), l'arancia dolce (Citrus sinensis) e il caffè arabica (Coffea arabica).
Una tecnica comune è la trasformazione genetica mediata da Agrobacterium tumefaciens, che utilizza il T-DNA per inserire geni nelle piante, consentendo la sintesi di auxine, citochinine e opine.
Il megaplasmide Ti contiene il T-DNA, che ha regioni terminali riconosciute da endonucleasi vir. Queste tagliano il DNA, permettendo al T-DNA di essere trasferito e integrato nella pianta ospite, facilitando la sintesi di auxine e citochinine.
Negli animali, esistono sistemi di rigenerazione come negli arti degli anfibi e negli invertebrati, che passano attraverso uno step intermedio di blastema per rigenerare i tessuti.
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